我是利用ABI -7300的机型 来做superarry的实验 这个superarry 有96的孔盘 每个 孔盘 有不同的primer来做侦测! 所以 我只需要 把 cDNA 做出来 再与一些Superarry 中所付的kit(SYBR) 一起加入稀释到一定的体积 然後 每个孔 加入25ul就可以 送入ABI-7300进行侦测! 所使用的Annealing 的温度也是60度( 其实 在操作上 没太大问题) 但 我想问问板上有经验的高手.. (因为这是我第一次实验呀) 1.通常 我在转cDNA之前时 一定会测OD260/280 但我这种的sample 每次测出来 最高只有 1.6 有时 还会 掉到 1.4 好几次 都是这样了 (我的sample 是monocyte的成 份较多)因是是血液性 不知 是否是这原因 而造成 ratio值低，因为我抽其它细胞 就没这种问题! 所以想问 是不是 ratio 值太低 所出来的real -time pcr 的data 就很难相信呢? 2.我这次的实验分成两组 (当然 一组是加药(a)另一组是没加药的(b) 在这一个96well 的孔盘中 其中有五种不同的internal control 分别是 b-actin 、GAPDH、B2M、HPRT1、RPL13A(後三种我没听过) 出来的average 在这两组中 分别差了 一个 Ct..就等於差了两倍.. 我整个就不知 该如何是好..在转cDNA之前 我是有定量的.. 但 如果 只单看 b-actin 在这两组 就没太大差别. 所以 我想请问的是 ..有什麽方便 可以使其定量 or normalization他们吗? 就是 能够让他们 一起比较?(当然 要把interal control 用後人为的方式让他们 一致化? 我想问specialist 但到现在 都没回电..所以..心好急呀.. 3.由於 这是第一次 做.. 我在想请问..到底 是要差多少个 Ct 值 才算真正有差异性? 因为 superarry 的网站上 有附上 excel档 让我们 做 data的整理.. 我输入後..当然 有差异性的 会有数字上颜色的变化 好让我们知道 是变多or 变少..而 这种敏感度 有辨法像是做 western blot 的方试知道 这种抗体的sensitivity 有多强吗? ex:在GAPDH 来说 只要 2pg 就可侦测到 之类的 问题有点多..希望板上的人 能够给些建议与指导... --

※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc) ◆ From: 220.133.53.154