※ 引述《kayle (kay)》之铭言： : 关於mammalian cell total protein extraction的问题 : 因为lab设备问题,无法用物理方式破细胞 : 我在网路上找了几个buffer : 目前用的是类似RIPA的配方 : 含Tris, NaCl,EDTA, 0.2% Triton, 0.1% SDS, 1mM PMSF : 10的6次方细胞加入50ul : 再把细胞lysis後,12000rpm,离心 30 min之後 : 有个取上清液的步骤 : 我可以很清楚的看到细胞被lysis, solution成透明 : 可是整个solution呈现很黏稠的的情况(DNA造成的吗?) : 几乎没办法取"上清" 这个配方的lyse算是很暴力的 破膜破核，许多membrane-associated protein都会release出来 我有做过类似的实验，为了extract顽强的membrane-associated protein 黏稠後100度去煮个十分钟(小心不要让水蒸乾) 溶液会不黏稠 之後dilute total solution volumn让solution中SDS浓度降低 这样之後sample可以IP，或做其他的用途 我这样做是OK 但是一般用buffer破细胞应该不需要加SDS吧 我自己的实验经验一般用NaCl配上Tx-100和其他八拉八拉的inhibitor 就很好用了 : 除了增加reagent用量外 : 该怎麽处理这个情况?? : 请有经验的大大帮忙一下,感谢!! : 另外一个笨问题 : SDS是很强的介面活性剂吧 : 那他到底会不会把protein denature掉?? 会喔，整个把native protein翻出来 : 那如果後续要做蛋白质纯化 (protein要有function) : 是不是就不应该用SDS?? 的确不能 : 那又该用什麽reagent来lysis细胞呢??? 就用一般的吧 我的lyse buffer(whole cell extract buffer)是 NaCl 150mM or 200mM Tx-100 0.2% Tris-HCl(pH 7.5) 20mM EDTA&EGTA 1mM 和protease inhibitor，DTT，若是要研究phosphorylation还 要加phosphatase inhibitor : 感谢!!! 希望对你有帮助 -- --

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