※ 引述《[email protected] (Vet)》之铭言： : 小妹很久没有做了 : 最近开始做 要做的是cKit (RTK), AKT and ERK : 我使用的lysis buffer 之前都没有问题 : 最近不知道怎麽好像出了问题 : 我在二月初有做一个sample as positive control 我收细胞wash : 之後用lysis buffer 4C shake 1 hr (浓度7 ug/ul) : 那个sample所有的东西都做的出来 : 可是过了一个礼拜 : 我做同一个实验 不过开始做treatment : 不过因为想要放100ug total protein per lane : 所以我放非常少的lysis buffer 而且改成冰上15 分钟 4C离心十五分钟 : 蛋白浓度在14 ug/ul左右 : 我用2x sample buffer loading dye跑gel : 可是很怪的是 我load一样的量 : 我第一次做的control(我拿来当western control) : 似乎比我之後实验组中的control(无treat)的高很多 : 也就是整个phospho-protein 强度 再我某个时期之後做的蛋白都偏低 所以是说phosphorylation level在你两次实验protein浓度一样的情形下变低罗? 会不会有可能是你的Ab的问题 可能隔一阵子了认的比较不好 也许整个western你两次做的condition不太一样 有点不太懂你的问题 要不要再PO详细一点^^ : 但是我的total protein是相同的 : 请问是因为我clear不乾净吗?? 我收的时候有觉得有白白的东西在上液体 ^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^ 是说lyse完离心後sup还有白白的东西嘛? 如果是有可能没有离乾净(有可能) 这样有可能影响到测protein浓度的正确 : 所以很多debrid都被我一起收下来了?? : 导致蛋白浓度根本是错的?? : 还是我蛋白浓度太高了?? 所以黏在一起 可是我有用95C 10 min : or 我的phosphase inhibitor失效了?? : 埃 我真的不知道问题在哪里 : 请各方高手替小妹指点迷津阿..... -- --

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