全部打完了才想到, 就算下面都懒得看也没关系, 这句比较重要: Ligation 接起来的东西因为机率 所以量少, 因为量少所以需要马上丢去 transform 给 E.coli 去放大... 然而 linear 的东西是不被 E.coli 接受的. 所以... PCR product + PCR product ligation 的放大... **** 晚上又失眠, 火气有点大一个不小心就把自己的东西给砍了... 好吧, 那时候乌鸦想的是... 乌鸦是猜啦, 大概是类似这样子: ----|---------------|----- pUC18 EcoRI (target) PstI 好了, 上面那是别人给你的, 或许是某个 cDNA clone, 然後老板想研究这东西. 於是乎想改接到 pcDNA3.1 之类的里面, 只是 pcDNA3.1 你想接的位置刚好不是 EcoRI 跟 PstI, 所以你想要用 PCR 方式制作切位, 好方便接到 pcDNA3.1 里面. ( 我都乱举的, 有没有那些 cutting site 我懒得去查 =____=" ) ^^^^^^^^^^ 分段 PCR 的意思在这边就是说... NotI XhoI ----|---------|-------------|---------|----- EcoRI PstI |<-----------(target)---------->| 比如说你要 PCR 的东西里面有两个 unique cutting site: NotI 与 XhoI 很幸运的就在开头跟结尾附近. 那就这样子啦... __ \-- <- primer #1 with HindIII cutting site ----|---------|------------------------------- EcoRI ---- <- primer #2 Primer #2 离 NotI 远一点会比较好, 因为到时候要切, 没留足够的长度 enzyme 会不好切; 但是太远也没必要. 这样子下去就会得到: HindIII NotI ---|---------|---- 的小片段; 然後同样的 primer #3 primer 4# 可以去弄出尾巴的小片段. 不过当然不是三个片段切一切拿去做 ligation... 把三个片段成功 ligation 起来的运气留着买乐透的时候用比较实际. 扯歪了, 找个类似这样子的 vector 当中间人: HindIII (与 EcoRI 不重叠) ---|---|--- // ---|--- EcoRI XhoI 或 PstI 先把你原本有的东西用 EcoRI 跟後面两个挑一个的位置接近去, ( 或 XhoI, 不重要, 反正多的往後 EcoRI NotI PstI 都要除掉. 後面假设挑了 PstI ) ----------|---|-----|---------------|-------------- HindIII -- plasmid -->|<----- target ------>|<-- plasmid -- 然後切掉要置换的, 纯化, 变成.. HindIII PstI NotI |------- // -------|--------------| |<---------------->|<------------>| plasmid DNA 去头target 呼... 好了, 可以跟前面提到 PCR 出来的小开头片段相接了... 这样子就换好头了, 同样的可以把 primer #3 #4 PCR 的尾巴也换进去, 最後, 就会达成换头的目的, 切下来在接近去你真正想要的 vector 里面... 其实不是什麽大难想法, 只是 BBS 不好画图(圆形) + 乌鸦表达能力不好罢了... 希望乌鸦写的东西对你有帮助. 对了, 在最後面突然就很想写... 乌鸦是这样子想的... 年龄跟老不老鸟是没什麽的. 老鸟, 某些实验你做的很好, 没什麽了不起, 只不过是你比我早接触, 碰的次数比我多, 这很正常. 要自己留招就算了, 不需要你的 " 哎哟, 连这都不会, 回去翻课本吧 " 要也请给我是哪本课本跟页数. 年龄, 就算你比我年轻, 以前某方面实验你做的比我多, 那你的身上自然有我可以学习的地方, 跟你学没什麽不好; 即使只是学些实验之外的巧思也是很好的. 重要的是你有没有在思考, 有没有想要更好. 知道的, 有空的: 欢迎请说. 不想帮也没关系, 但冷嘲热讽这类即使只是表情也就都免了. 在你看来 " 基本 " 的东西, 对别人不一定基本. --

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