作者lentivirus ()
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标题Re: [方法] 如何对plasmid做site-directed mutation ?
时间Sat Oct 20 21:42:58 2007
其实做site direct mutagenesis方法还蛮多种的，
这个方法还不错用
1 3
(RE1)----> ---->
RE1------------------X------------------RE2
<---- <----(RE2)
2 4
A: (RE1------------------X---)
B: (---X-------------------RE2)
C: (RE1------------------X-------------------RE2)
1st PCR: 分别做 primer 1 及 primer 2, primer 3 及 primer 4
得product A 及 product B (template source: target plasmid)
要将product cut and purify
2st PCR: 分别做 primer 1 及 primer 4
得 product A、B、C (template source: product of 1st PCR (1:1)
取product C--->purify, cut by RE1 and RE2
将target plasmid for SDR, cut RE1 and RE2 (取长段，短段为置换)
Ligation---transformation--->colony identification by sequencing
Note：RE1-------RE2的长度当然愈短愈好，一般大概三到五百bp
RE1及RE2最好是unique site (避免cut vector)
primer 2,3 design部分最好要变的点在中间，前後各延长10~15bp
GC结尾，specificity较高
以上我常用的方法，另外还可以用PCR的方法跑一整圈plasmid，
然後用Dpn1 cut 再接，实验室有人做，应该是ok
有需要再提供给大家好了...我也没实际试过 ^^""
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◆ From: 61.217.31.60
1F：推 rickson:有钱的话直接去买mutagenesis kit，然後primer不需要纯化 10/20 22:01
2F：→ rickson:多挑几个就好了 10/20 22:02
3F：推 blence:何必买kit,以一般不易突变的pfu做PCR的reagent拿来用就ok了 10/20 22:18
4F：推 liuse:我也都是用楼上说的 pfu 做完记得定全长确定其他没错 10/20 23:39
5F：推 aggaci:好麻烦 直接quick change不就好了 10/22 03:16
6F：推 HUVEC:我也是用quick change，不过贵一些就是了 10/23 14:27