作者yumei (爱自己最重要)
看板Biotech
标题[求救] PCR,以前做的出来,现在做不出来了?
时间Wed Oct 24 16:43:45 2007
请教版上的PCR高手们,
我目前做的题目是关於细菌的基因,
我做的是阴性菌,目前在检测细菌中是否带有特定的基因,
这个实验在今年二月做过一部份,结果良好,一切都没问题,
因为之後收到更多的菌株,因此在九月时又重新进行此实验
结果非常惨,再也跑不出来了!
连之前二月做的阳性菌株,现在也无法跑出我要的产物
原先怀疑是PCR的问题
所以目前试过3家dNTP,4家Taq,
调整过镁离子浓渡由1.5mM试到2.5mM,结果连水都出现伪阳性
改变annealing的温度下降2-4度
都无法再度amplify出正确产物,
後来又怀疑是否DNA有问题,
又重抽DNA两三次
(使用过phenol/chloroform/Isoamyl Alcohol的方法也试了用kit抽DNA)
还是没办法Orz
目前还没试的,只剩下加DMSO了
(等会就知道结果了T_T)
可是我二月时不加DMSO也可以跑出来呀~~~
有人可以再给我不同的建议吗?
试了快两个月了,再做不出来,我真的可以不用玩了Q_Q
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※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 140.112.96.207
1F：推 HIbaby:primer是新的还是旧的/ 要不要换另一组primer试试 10/24 17:01
2F：推 HIbaby:假阳性的产物 有定序过吗? 二月的产物有定序看过序列吗 10/24 17:02
3F：推 yumei:忘了说,primer有重新合成,新旧primer都试过 10/24 17:12
4F：推 yumei:二月产物有定序,是ok的,伪阳性无产物太弱,无法定序 10/24 17:15
5F：推 HIbaby:如果我是你 我会换不同位置的primer来试 10/24 17:25
6F：推 HIbaby:另外 做southern试试? , PCR水够乾净吗? 用隔壁的PCR机器 10/24 17:26
7F：推 yumei:谢谢你的建议,我明天会试另一组primer--之前试了一次是失败 10/24 17:43
8F：→ yumei:PCR水应该是ok的,我们家实验室有好多台PCR机器,我应该都用了 10/24 17:44
9F：推 enisx:PCR buffer 坏了? 有这种问题我都reagent含水全部换掉 10/24 17:48
10F：→ enisx:很多因素会使得PCR发生问题而作不出来,先用作得出的人的东西 10/24 17:49
11F：→ enisx:再作一次看看吧! 当然如果你时间很多,一项项试误找原因也可 10/24 17:50
12F：推 yumei:我试了四家Taq,buffer都有跟着换 10/24 17:50
13F：→ enisx:找作得出来的人协助看你问题出在那! 10/24 17:51
14F：推 snkre:dNTP有可能坏了,可拿别人可以work的dNTP试试 10/24 17:54
15F：推 yumei:加DMSO的结果出来了~失败Orz...而且今天是别人帮我试的结果 10/24 18:37
16F：→ yumei:这组primer可能没救了吧....Q_Q 10/24 18:40
17F：推 HIbaby:换primer比较快啦..换不同序列的 机会比较大 10/24 18:53
18F：推 peggie0903:dNTP的浓度是对的吗？ 我刚进实验室时一直拿十倍的～ 10/24 22:25
19F：→ peggie0903:做超久都做不出来 （好险老板没生气） 10/24 22:25
20F：推 dankai:镁离子浓度也不可过高...会影响dNTP作用~我实验室学长就是 10/24 22:43
21F：→ dankai:多加了镁离子..作了很久都做不出来!最後降低镁离子就出来了 10/24 22:45