我把你文章重排了一下 比较好回答 ※ 引述《[email protected] (我要蓝蓝淡淡的天空)》之铭言： > 请问western blot中secondary antibody使用过多 > 会造成许多的bnad吗? > 因为我是第一次用这个secondary antibody(sigma的anti-rabbit IgG HRP) > 一时找不到手册又很赶的情形下.. > 不加思索的使用1:10000的稀释下去做... > 结果後来才想到网路上就能找了= = > 结果说明手册说建议1:160000...哇靠..整整差了10倍 > 冲片出来的结果也很怪 > 好像..band有点多.. 欲速则不达 这是我的经验谈 为了快 该作的 control 没作 最後一定倒大霉 建议拿到新的 2nd Ab 之後要先作一次不加任何 primary Ab 的 control 确认一下 background 的状况先 > 还有..要是我真的secondary antibody用太多 > 除了重做以外还有救吗= =.. 如果你的 sample 真的很珍贵 可以试试看 strip 以後重作 http://www.protocol-online.org/prot/Molecular_Biology/Protein/Western_Blotting/S tripping_Western_Membranes/ 虽然个人还是建议重作比较好 > (不过这次用的primary antibody..lab中学长没有使用成功过..也就是用了没有band出来) > 我还满害怕我的结果会不会是因为我secondary antibody过多造成的... 有没有试过去认 overexpressed protein? 如果 overexpress 的都认不到那这支抗体就根本不能用啊 如果可以 那才可能是灵敏度的问题 > 还有..做回来的antibody的specific都大概会是怎麽样.. > 因为之前大多做的是直接买的(GST..His-tag等) > 这次做的是由前人纯化的protein去打兔子出来的 > 拿到是一整管类似血的东西(应该是血吧..) > 这样做的specific会不会有影响? 应该是血清 我不知道你说的 "有影响" 是什麽意思 抗体百百种 每一支的特性都不同 一定要测过才知道 绝对不可以先假设各种抗体都一样啊 比方说你有一个含有 1. his tagged protein X 的样品 以及直接购买的 2. anti his Ab 还有打兔子打出来的 3. anti protein X Ab 如果你用完全一样的 protocol, 用 2. 或 3. 染 1. 得到的结果几乎一定会不同 -- And my soul from out that shadow that lies floating on the floor 在那地板上浮动的影子中的我的灵魂 Shall be lifted- nevermore! 将永不再起... --The Raven by E.A.Poe -- ※ Origin: 生命科学 BBS <bbs.life.nthu.edu.tw> ◆ From: cpe-66-61-25-6.neo.res.rr.com