作者cutebetty (Qb)
看板Biotech
标题[求救] 2D几个问题
时间Mon Oct 29 21:46:24 2007
目前在进行2D时有一些问题发生
前几次的实验结果PAGE上的点都会有拖曳的情形发生
针对我实验的过程我有几个问题想请教板上的高手
1.如果要改善是否要调整IEF时Vhr的值?!
现在是用前人试过的条件来跑
我使用的是Bio-rad的 pH4-7 7cm strip
IEF条件为
50V rapid 30min
200V rapid 30min
1000V rapid 1hr
4000V linear 1hr
4000V rapid 33000Vhr (会不会太多)
200V rapid 维持
因为我翻参考资料 一般来说好像没有设这麽多的电压
我也不大清楚 rapid和linear的目的在哪?
2. 以7cm的strip来说 蛋白质的量最多可以加到200ug吗?
3. 有些参考资料说增加DTT的量可以提高2D解析度 那是增加在rehydration的步骤
还是在equilibration的步骤?
4. 再者 一个很蠢的问题 做PAGE时要做上胶吗? 我是都有做啦....
5. 跑12% PAGE时电压我都用100V 可是Bio-rad建议是200V 哪一个较佳?
6. 最後 有哪些地方的改善是可以减少蛋白拖曳的情形? 除了加DNase外
希望大家可以提供我ㄧ些建议 感谢
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※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 140.129.77.129
1F：推 aggaci:2D....好恐怖的实验..想到就头皮发麻 10/29 21:47
2F：推 NKTcell:蛋白拖曳 是拖直的还是横的勒? 横的话就是sample没处理好 10/29 22:26
3F：→ NKTcell:里面盐类太多 直的话就是第二维速度可能太快 10/29 22:27
4F：→ NKTcell:第2,3点 strip买来的时候说明说应该有写吧 10/29 22:28
5F：→ NKTcell:我也有做上胶 可是上胶是Agarose 10/29 22:29
6F：推 dankai:推楼上! ^^ 我的电压最高用到8000V~ 10/29 23:20
7F：推 cutebetty:我说的上胶是指一般PAGE的上胶,因为看说明书好像没写要 10/30 09:30
8F：→ cutebetty:楼上的电压8000V是用7cm的吗? 8000V好像太强了 10/30 09:31
9F：→ cutebetty:说明书上是写7cm建议蛋白量最多为500ug 我是怕放太多解 10/30 09:31
10F：→ cutebetty:析度会不好,目前我是发现横向拖曳的情形,所以是盐太多罗 10/30 09:32
11F：推 dankai:^^ 我是做13cm~没说清楚!抱歉~~~~ 盐太多!多洗几次sample~ 10/30 11:34
12F：推 Linton:1.单边拖or双边拖? 4.都可以 5.有冷却系统就200V,没有就100 11/02 22:37