※ 引述《scherzoinb (scherzo in B Op. 20)》之铭言： : 目前transform一直长不出来 : 在做完double digestion後 : 做ligation，插入一段insert : transform 到competent cell里 : 目前能确认的是︰ : 有做single digestion，确定enzyme都能切 : insert的切位是设计好的 : transform是用heat shock的方式 : 师说︰用电穿孔的效率比较高 : 还没试过 : 找不到问题出在哪里 : 做了快一个月 : 麻烦各位大大 : 帮忙一下 : 感激... : 第一次做clone的新手... 电穿孔要使用cuvet..用完还要洗..个人觉得很麻烦 而且competent cell制作比较麻烦(以时间观点来看啦..外加我很懒..XD) 基本上如果你要transform的大小不太大的话 能用heat-shock就用heat-shock 你应该在每次做的时候都加入一组control control是什麽?就是你没切过的vector..直接拿1 ul做一组heat-shock 理论上这一组应该可以长很多很多..如果没长的话表示你操作有问题 要是长很少的话表示你这批competent cell效率太低 效率太低的话建议你重做一批..做cloning效率要是太差也很麻烦 另外..你做ligation的时候..insert:vector比例是多少..? 还有你vector size跟insert size呢? 此外..你ligation的条件跟时间呢? ㄜ..其实我一般来说是根本不管他的size啦XD 反正就直接拿很多的insert+很少的vector... 每天下班前丢4度冰箱给他over-night.. 第二天再来transform..或是把PCR设定成16度3小时 用PCR管子做ligation 不过大多我都是选择overnight..时间比较好控制XD 第一次做会卡比较久啦..因为很多操作还不熟悉的关析 我第一次做一个成功的花了我三四个月吧.. 然後就是无止境的做各种新的construct(实验需要..(哭)) 到目前为止已经可以达到两周可以交出一个定序完整的construct了XD.. 果然实验都是做久就会熟练 PS:可是每次做完後又会多出新的来做..囧 -- 上帝曾经说过 : 当一个人打你右脸的时候 你就要用日耳曼背桥摔坏它的左脸 --

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