vector: pETBlue己接上要表现的gene，约4.5Kb insertt: 做纯化用的，his tag，约24bp control没做...会记得要做 ligation: vector:insert=1:3 T4 ligase:16℃、16h (fermentas) total volumn: 10μl competent call: nova blue 有人跟我说︰试试看把ligation的温度提高到20 or 22℃ 也有人说试试看用切enzyme去切5'端的phosphate 谢谢bluecsky大大给的意见...感激... 希望有经验的大大...能多提供一些意见...谢谢... ※ 引述《bluecsky (我要蓝蓝淡淡的天空)》之铭言： : 电穿孔要使用cuvet..用完还要洗..个人觉得很麻烦 : 而且competent cell制作比较麻烦(以时间观点来看啦..外加我很懒..XD) : 基本上如果你要transform的大小不太大的话 : 能用heat-shock就用heat-shock : 你应该在每次做的时候都加入一组control : control是什麽?就是你没切过的vector..直接拿1 ul做一组heat-shock : 理论上这一组应该可以长很多很多..如果没长的话表示你操作有问题 : 要是长很少的话表示你这批competent cell效率太低 : 效率太低的话建议你重做一批..做cloning效率要是太差也很麻烦 : 另外..你做ligation的时候..insert:vector比例是多少..? : 还有你vector size跟insert size呢? : 此外..你ligation的条件跟时间呢? : ㄜ..其实我一般来说是根本不管他的size啦XD : 反正就直接拿很多的insert+很少的vector... : 每天下班前丢4度冰箱给他over-night.. : 第二天再来transform..或是把PCR设定成16度3小时 : 用PCR管子做ligation : 不过大多我都是选择overnight..时间比较好控制XD : 第一次做会卡比较久啦..因为很多操作还不熟悉的关析 : 我第一次做一个成功的花了我三四个月吧.. : 然後就是无止境的做各种新的construct(实验需要..(哭)) : 到目前为止已经可以达到两周可以交出一个定序完整的construct了XD.. : 果然实验都是做久就会熟练 : PS:可是每次做完後又会多出新的来做..囧 --

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