作者grandia (香蕉S大王)
看板Biotech
标题Re: [讨论] in vitro kinase assay 与IP的差别 ??
时间Thu Nov 15 01:01:15 2007
※ 引述《natual (穿梭於药品之中....)》之铭言：
: 敢请各位大大能否帮小弟我解答一个问题.最近看paper想不出的问题
: in vitro kinase assay 会作IP.但我的疑问是既然两者都是用抗体去抓抗原的原理
: 那问什麽还要作transfection.多一道步骤
: 乾脆直接去找一个会与substrate作用的东西直接作IP去抓就好了..
: 这就是我的疑问 .....希望各位大大能给小弟一点指教
小小的提供一点意见
in vitro kinase assay 意指你要测量的protein是个kinase
需要透过IP的方式 把该kinase IP出来 然後在in vitro的方式 加入substrate
以及isotope P32 (或是其他label方式) 来测试这个kinase是不是有能力去将
substrate磷酸化
那target kinase 我看过有人会先overexpression 再用anti-tag ab去把protein作
IP 或者 也有人直接去用kinase specific ab 把 endogenous kinase IP出来 进行
後续的实验 但是 经验上 用tag ab去做IP的效果好很多 最起码IP下来的protein量
真的比较多 第一因为protein经过overexpression 第二抗体效率比较高
相较於直接用specific ab去抓protein 第一 细胞内生性的protein量一定比
overexpression的来的少 第二抗体作IP的效率也没有tag ab来的强
因此作endogenous protein要让你IP出来 且要能进行接下来的kinase assay经过数次
wash等等 需要的protein量一定要够多 不然也做不出来
所以 overexpression後 再做in vitro kinase assay是很常见到的方式 相对的也简单
许多
不知道有没回答你的问题...
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※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 140.129.62.51
1F：推 blence:这个实验通常有两种目的,一个是看上游讯号对kinase活性变化 11/15 02:55
2F：→ blence:像cdk在不同cell cycle活性,是常以endo为主;至於探讨kinase 11/15 02:56
3F：→ blence:活性与不同的mutant construct的差异就几乎只有overexpress 11/15 02:59
4F：→ blence:可以选择; 一般来说除非没有可IP的抗体,不然用tag只是实验 11/15 03:01
5F：→ blence:前置测试,最终还是要回到endo的实验才比较被认同 11/15 03:06