不好意思我不是很懂您的问题所以可能有风牛马不相及的可能 不过我想您的transform不成功的原因很有可能是 1.您确定您的inserte在回收後够浓吗? 在UV灯下切gel时尽量不要太久 我学长是说太久的话会不好ligation XD 我不清楚版上各位回收这种小片段的DNA时会如何处理 不过我的经验是 我们实验室的kit只要低於500bp的DNA就不好回收 因此我会采取将elute的产物 重复拿来elute的动作来弄浓(包含加热) 不过缺点是可能导是DNA的断裂而不好ligased 2.您的double digestion作的时间适合吗? 其实现自我都会尽量避免不是和的double digestion 我的经验是如果两种酵素有可能 over digestion纳反易绳间依该尽量不要超过1hr 即使如此仍有可能因为酵素乱切 而让ligation更不易 (不要浪费自己时间阿 > <) 3.您的vector似乎很大 那有确定有切乾净吗? 我以前经验 若我当vector很大时 而我的酵素切位很近 那我会尽量不用over digestion 而先以低盐的酵素切(可以切久确定有切乾净) 然後再藉由加热去活性 再加大体积到 高盐的酵素理切(我印象中很像低盐以及低PH都会让酵素over digest) 尽量避免over digest 我的经验中over digestion是ligation失败的重要原因之一 另外 这步骤是要你确定有切乾净 不然到时您转殖出来都是vector的菌 中间会浪费好多宝贵的时间 有些东西一下没法想到 不过原则是 1.DNA要够浓 即使是vector也不能太淡 不用担心ligase会被盐类影响作用 我试过即使我ligation时不补水也能ligase得不错 2.不能over digestion 但你要能确定你有切乾净 3.你的competent cell效果要好:) 祝您顺利唷^^ (P.s这是个专题生的小小经验 如有误请多多鞭挞XD) --

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