嗯 谢谢那位大大推那麽多文 我了解那公式了 我说的y=mx+b这个 ｘ轴是ＤＮＡ量 Ｙ轴是ＣＴ值 当斜率Ｍ　＝　－３．２左右（刚查到　可是不知为什麽　＝　＝） 会有最佳效率 现在我还是不知为什麽会有这值＝　　＝ 请会大大的教我一下 谢谢 ※ 引述《Phaeton (凰呀的鸣叫~)》之铭言： : 请问一下喔 : 因为想了解Q PCR : 所以爬文找知识 : 看到这篇里面提到的重要公式 : 我在知识+和GOOGLE都找不太到 : 可以请哪位大大解释一下 : Y是什麽?? : 而N应该等於多少？？ : ＣＴ值吗？？ : 另外我可以用斜率的方式来看ＥＦＦＩＣＩＥＮＣＹ吗？？ : 就是用 Y = MX + B的方式来看　 : Ｍ应该要等於多少才会有最好的效率？？ : 谢谢 : ※ 引述《rpr (Cathy)》之铭言： : : PCR有一个重要的公式 : : y=(1+e)^n e是PCR反应的效率,而n次方指的就是cycle number : : 就我所知real-time PCR,是希望每一个PCR反应能尽量达到 e=100% : : 所以才会限制产物大小 (<250 bp) 跟反应温度(2-step PCR) : : 当然对於template的要求也是非常的高 : : 如果你的template quality不佳,做出来的结果常常会认你吐血 : : (我在做基因定量,range只有1-4 copies,但是Ct差个1结果就差两倍,真的会吐血 : : 观察国外这方面做的好的实验室,对於template的quality要求是严格到不行) : : 如果你都按照他的限制下去做,基本上他们是可以保证一定可以得到很好的结果 : : 但是温度是绝对可以调整的 : : 如果你的基因在3-step PCR做的2-step PCR还好,当然没有理由不调整温度 : : (这又牵涉到primer的设计,所以他们也出了一套软体专门帮你设计适合的primer) : : 只是你要确定这样条件下的e比他们条件下的e来的好 : : 另外,反应体积也是要尽量精确,因为reagent里还有ROX dye, : : 机器会在判读时拿这个萤光作为不同well之间体积的校正 : : (但是怎麽校正我就不清楚了,有兴趣者可以自行测试,再来跟大家分享吗?) : : 不过一我的经验,差个1-2 micro-liter是影响不了多少啦!(我做25 micro-liter的) : : RT Real-time我也做过,用的是TRIzol抽的 : : OD 260/280实在不怎麽好(说来惭愧,1.6我就欢天喜地了) : : 但是也都做的出来 : : 刚开始还傻傻的买他的one-step RT-PCR reagent(贵到爆) : : 後来也开是自己转(我用过BD以及invitrogen的kit) : : 但是结果仍然满意,所以抽RNA跟RT的kit应该是影响不大 : : 反而是你操作的好不好的问题 : : 另外你的反应做大於40 cycle,然後Ct只会在40以後出现 : : 我也如bloodgas大大会建议你看一下internal control的Ct会在多少出现? : : 可以一并确认是quality的问题 或者你的基因表现就是低到不行 : : 希望对你有所帮助 --

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