作者wangba (原来...)
看板Biotech
标题Re: [求救] transformation的问题
时间Mon Nov 19 14:18:33 2007
※ 引述《bluecsky (我要蓝蓝淡淡的天空)》之铭言：
: 用PCR的方式就是你要重做整个insert
: 也就是你要做his-tag+insert这整个DNA
: 不过似乎跟你原本想要的方式又多了一道手续
: 因为必须重新PCR做insert
: 这样接好之後还是必须重新送定序
: 要是原本的gene长度比较长..有时候会容易出现一些mutation
: 假如是要用his-tag..为什麽不找方便的切位直接切下
: 接到含有his-tag的expression vector呢?
: 因为如果真的只有24 bp的话..
: 我还没接过这麽小的XD..不知道会不会有什麽问题产生
如果怕PCR会产生mutation 其实可以试试用primer架桥的方式
图示如下:
BamH I EcoR I
G
GATCCctctgttcaac ggggacatgctctg ttcaacggggacatgG AATTC
CCTAG
Ggagacaagttgcccct gtacgagacaagtt gcccctgtacCTTAA G
如上图所示 小写部分是欲加入的小片段
可以分成六条primer 用BamH I和EcoR I处理过vector之後
将合成的primer加入一起做ligation
记得primer 5端要先磷酸化 也不可以用CIP处理
可以试试看 加油
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※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 140.123.86.42
1F：推 scherzoinb:这我还是第一次听见耶...分生的知识不足...唉... 11/19 18:31
2F：推 scherzoinb:CIP是不是用在blunt end，sticky end不能用这个是吗？ 11/19 18:33
3F：推 scherzoinb:谢谢你罗...感激... 11/19 18:36
4F：推 bluecsky:应该说blunt end比较需要CIP处理一下 11/19 20:07
5F：→ bluecsky:CIP是去掉5'的磷酸..避免两个blunt end成self-ligation 11/19 20:07
6F：→ bluecsky:sticky end不是不能用..而是不需要.. 11/19 20:09
7F：→ bluecsky:因为两个都是stick end的话是无法self-ligation的 11/19 20:09
8F：推 skylawer:楼上有一点点语病 是指两端是不同 cutting site 比较精确 11/20 00:45
9F：推 bluecsky:哈..感谢楼上帮我补正 11/20 08:03