最近花了一点时间在测试matured miRNA的PCR侦测法 有点心得可以跟大家分享 由於miRNA是只有23~27 nt大小的RNA片段 无法直接使用一般PCR去侦测，所以必须要想办法将之延长 常见的作法是接上linker或者使用特殊的RT primer 我们Lab试过的方法有两大种，都包括Kit以及後来自行modified的方法 第一种是先将RNA用Poly A polymerase加上oligo(A) 然後用加上linker的oligo(dT)RT primer做fisrt-strand synthesis 如此做出的cDNA大致上会到80~90 nt 之後就可以使用matured miRNA的sequence当作forward primer (当然，U要用T代替)，Linker上面的sequence当作reverse primer 就可以进行SYBR green I based 的qPCR 这种方法的Kit 可以参考I厂的 nCode 第二种是使用特殊的stem-loop RT primer 此RT primer全长约50 nt，前面6 nt需要和目标miRNA互补，後面则形成stem-loop的结构 这样子产出的cDNA是约~75 nt 可以使用位於stem-loop中间偏後位置当reverse primer miRNA扣除末5 nt的sequence当作forward primer 也是一样可以进行SYBR green I based的qPCR 而若是需要probe，可以取miRNA跟RT primer间的sequence 这种方法的Kit请参考A厂的Taqman assay 把各种方法特点表列如下 第一种 | 第二种 | poly A required x RT-primer universal specific F primer specific specific R primer universal universal 使用时的感觉，若是使用primary tumor cell 则会发现第一种方法的melt curve非常混乱 但是stem loop法就比较单纯的单一波峰，做出来的SD也比较小 若把kit也考虑进来的话大致上用起来的感觉是 (注: 此为本人使用心得，不一定具代表性) 优 >>>>>>>> 劣 价格 I厂 <= 1 < 2 << A厂 SD A厂 < 2 < 1 = I厂 时间 A厂 <= 2 < 1 = I厂 侦测能力 A厂 = 2 >>> 1 = I厂 C/P值 2 > A厂 > I厂 > 1 若是预算不用考虑的话，A厂会是省时间的好选择 若是有时间设计primer的话 2 可能是比较好的选择 以上所述 欢迎多多指教鞭笞 若是有需要RT primer的sequence可以再找我 参考资料: 1. http://www.protocol-online.org/biology-forums/posts/16271.html 2. Caifu Chen, Nucleic Acids Research, 2005, Vol. 33, No. 20 e179 --

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