作者jeff20628 (goddtv)
看板Biotech
标题real time PCR遇到问题!!!
时间Wed Nov 28 21:49:51 2007
我将老鼠组织抽其RNA,抽RNA过程有使用到phenol跟chloroform,
抽完後,做RT,然後做real-time pcr,
第一次这样做都没出现任何问题,基因也做完了,
然而老师要我再做另一只老鼠,一般实验都会做两只以上一样情况下的老鼠基因PCR,
於是这次我一样抓另一只老鼠,方式同第一次,抽完RNA做RT,
重点是RT做完後,我就先用一般的PCR先看RT有没有成功,我GAPDH放大约19 cycle就
pcr出来了,於是我就去做real time pcr,奇怪的事出现了,居然侦测不到,
第一次做GAPDH大约在15~20 cycle之间就可以PCR出来,但是这次real time pcr
我调到44cycle,居然也看不到GAPDH这个基因,这只是我的control而已阿> <
我再回去用一般PCR机器(加的enzyme是taq),的确在19 cycle就pcr出来,
但是real time pcr就是失败!!!
重点来了,我拿上去的template来做,的确GAPDH在15 cycle左右就出现曲线了阿,
为何这次的template居然在rt-pcr可以成功p到GAPDH,但是用real time pcr就失败= ="
怎麽说都搞不懂,如果RT失败,应该连一般PCR都失败阿,为何只有REAL TIME PCR失败阿
高手救我阿,还是我有phenol或chloroform些微残留,却只会影响real time pcr的萤光
enzyme,一般的enzyme都不会影响???real time pcr的enzyme是不是比较脆弱阿= ="
救我阿 做到快哭了 还是重抽RNA,然後小心一点= =
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※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 140.115.48.75
1F：推 NKTcell:会不会是real time的reagent出问题了 or PCR过程中用到的ꨠ 11/28 22:23
2F：→ NKTcell:东西已经被污染 11/28 22:24
3F：推 jeff20628:因为我有用之前的template去试,可以正常p出来 11/28 22:47
4F：→ jeff20628:所以目前发现只有template有问题,但他用一般pcr却可以 11/28 22:48
5F：→ jeff20628:P出GAPDH= =? 11/28 22:48
6F：推 laba72:不好意思.请问你有听过 CapSwitch oligonucleotide 11/29 19:28
7F：→ laba72:因为之前书报的PAPER有看过..但看不懂他的意思 11/29 19:28
8F：推 fungihsu:请问是用Taqman还是SYBRGreen? 12/01 18:15