※ 引述《foureyes ()》之铭言： : 从九月开始就在作构筑质体的动作 : 老师要我用 PCR 夹出 insert 片段　 : clone 到 pET32c 上面後 transform 到大肠杆菌里面去做表现 : 我 transform 完後在 LA plate 上有长出菌落 : 我以为这样就表示有接到? 因为之前曾经长不出菌落过 : 然後挑菌落转养後抽质体确认 : 用与 digest 时相同的酵素 HindIII & NdeI 来切 : 37度C 反应 2小时15分钟 : 跑电泳却没有看到理论上一大一小的片段 : (我的小片段应该是 500 bp 左右) : 已经重复五六次了都没有看到小片段 : 请问这表示我根本从头到尾都没接到吗? : 我看有人说用两种酵素的话要分一前一後处理 : 我是两种酵素一起加下去 : 会是这个原因所以切不出来吗? : 还是有其他的问题? : 先谢谢大家了(跪) 阿..都重覆了5 6次了.. 而且你digest的时间都这麽长了 不应该有切不出来的现象(除非你enzyme加真的很少很少..应该不可能吧) 就相信他吧..乖乖去重新ligation一批吧.. 有长不一定是你有接好转进去 很多时候都是false positive.. 假如你之前的都没长colony的话 建议你从抽vecoter跟PCR insert这边重新开始 把整个实验都重新setup一下 做construct就是这样..反正一直做不出来就从头开始再弄一次 有时候就会出来了 我一般enzyme digest是用来做二重确认才做的 第一步都是用PCR screening 直接用牙签点一下colony然後再点一下到PCR的管子中 加入适当的primer跟buffer dNTP Taq..就开始做了 (primer我会选insert的forward primer跟vector上的reverse primer) 一次可以快速的screeningㄧ堆 再把screen出现positive结果的在点去养broth 之後才用enzyme digest做第二次确认 大多两种enzyem各1 ul..用於total体积20 ul 切一小时 就很够了 -- 啊！我们真的是拼图(喘) ╭╮ ˊ ┌──┬┘└┐ ╭┘ ╭┘ │ ╰┐╭╮┐╭╮│)) └┘└┴┘└┘ --

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