给你另一种测试的方式 举例：先准备两种菌种 一个是你Ligase inasrt之後的菌... 一个是直接transformation 空plasmid的菌 在有insert的disc中取20个clone 没有insert的dice挑一颗 clone（就是plasmid only的菌） 做NC 养个3ml o/n 这20+1个菌液各取个50μl 以等体积加入phenyl/Chloroform extraction mix 离心个十分钟 (直接把菌打破，让DNA plasmid 都悬浮出来) 再取上层液直接跑个小於1%的胶 如果有insert的话，理论上跟空plasmid来比 会出现较高的Band........（就是空palsmid 和有insert的差异） 再从有上飘的哪几个clone挑出来切enzyme...... 跟PCR的方式来screen 没有好坏之差，只是方法不同罢了 给你个建议，请慢用 ※ 引述《bluecsky (我要蓝蓝淡淡的天空)》之铭言： : ※ 引述《foureyes ()》之铭言： : : 从九月开始就在作构筑质体的动作 : : 老师要我用 PCR 夹出 insert 片段　 : : clone 到 pET32c 上面後 transform 到大肠杆菌里面去做表现 : : 我 transform 完後在 LA plate 上有长出菌落 : : 我以为这样就表示有接到? 因为之前曾经长不出菌落过 : : 然後挑菌落转养後抽质体确认 : : 用与 digest 时相同的酵素 HindIII & NdeI 来切 : : 37度C 反应 2小时15分钟 : : 跑电泳却没有看到理论上一大一小的片段 : : (我的小片段应该是 500 bp 左右) : : 已经重复五六次了都没有看到小片段 : : 请问这表示我根本从头到尾都没接到吗? : : 我看有人说用两种酵素的话要分一前一後处理 : : 我是两种酵素一起加下去 : : 会是这个原因所以切不出来吗? : : 还是有其他的问题? : : 先谢谢大家了(跪) : 阿..都重覆了5 6次了.. : 而且你digest的时间都这麽长了 : 不应该有切不出来的现象(除非你enzyme加真的很少很少..应该不可能吧) : 就相信他吧..乖乖去重新ligation一批吧.. : 有长不一定是你有接好转进去 : 很多时候都是false positive.. : 假如你之前的都没长colony的话 : 建议你从抽vecoter跟PCR insert这边重新开始 : 把整个实验都重新setup一下 : 做construct就是这样..反正一直做不出来就从头开始再弄一次 : 有时候就会出来了 : 我一般enzyme digest是用来做二重确认才做的 : 第一步都是用PCR screening : 直接用牙签点一下colony然後再点一下到PCR的管子中 : 加入适当的primer跟buffer dNTP Taq..就开始做了 : (primer我会选insert的forward primer跟vector上的reverse primer) : 一次可以快速的screeningㄧ堆 : 再把screen出现positive结果的在点去养broth : 之後才用enzyme digest做第二次确认 : 大多两种enzyem各1 ul..用於total体积20 ul : 切一小时 : 就很够了 -- 夜生活不只是一种生活，更是一种态度，音乐有很多类型，夜店有很多种类 喜欢与否只是一种偏好，却不代表全部的选择，夜生活的多样与多变应该是 让人有更多更广的眼光看生活与体验......... --

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