作者tsubasawolfy (悠久の翼)
看板Biotech
标题[求救] Phosphoprotein的western
时间Mon Dec 3 12:02:59 2007
最近新买两只QIAGEN的Anti-phosphoserine跟Anti-phosphothreonine弄得很困扰- -
因为Background一直过高．．．(第一片海苔就献给它了．．)
高到肉眼就可以看见membrane整片都发光(serine最严重)
不过band还是可以看的清楚(３０秒以下可以 压３０秒以上就会无法辨认)
Blocking跟一抗二抗的条件都照它Hand book写的操作
Blocking:1X TBS, 5% BSA,RT,2hr (hand book是写1hr..至於RT跟4度C都试过 没有差异)
First Antibody:1X TBS,5% BSA+0.1%Tween 20, 4度C, O/N
(Serine-mouse IgG,IgM Threonine-mouse IgG)
Second Antibody:1X TBS, 10% milk+0.1%Tween 20, 2hr
(Cell signaling, Anti-mouse IgG)
做胶跟跑胶的buffer也都重配(running buffer跟transfer buffer不回收)
hand book的trouble shooting也只写background过高是因为BSA blocking能力不好
所以二抗才会用10%milk补强(也没写解决方法= =a)
目前自己有嚐试过降低１抗浓度 从厂商预设的1:100-1:200降到1:500
不过海苔还是一样一分钟就烤好了Orz
还有几个方案(还没试)
1.提高blocking跟一抗的BSA浓度(5%->10%)
-这不知道有没有用..
2.blocking时间延长
-这感觉比较没用 因为一抗也是用同浓度BSA配还overnight
3.一抗浓度降更低 1:1000试试看
4.一抗不要O/N 试个2-4hr看看
目前就只想到这几个 不知道还有没有哪位先贤可以提供一下其他改进意见..Orz
(买新抗体除外= =)
ps至於是否可能二抗乱抓的问题．．有用其他Antibody测试过没有乱抓的问题
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◆ From: 124.8.178.224
1F：推 blence:你有没有想过BSA其实都是有phosphorylation的form? 12/03 12:43
2F：推 racher:我以为是caseinh才会有phosphorylation form耶!! 12/03 14:28
3F：推 tsubasawolfy:一楼的问题我有想过 但是他hand book上面没有写明 12/03 16:31
4F：→ tsubasawolfy:要哪种BSA..所以我是直接买新的SIGMA-BSA 98% 电泳级 12/03 16:31