作者sinlu (懒的换昵称!!)
看板Biotech
标题[讨论] 请问有关reai-time PCR
时间Tue Dec 11 22:41:30 2007
大家好^^
目前是新手 在做real-time PCR遇到一些困难
我用的是Taqman的方法
probe以及primer都是用前人所设计出来的
我目前就是跟某家公司定他之前所设计出来的序列去跑
我遇到一些问题
就是我跑出来的曲线Ct值OK 反应结果如预期
但是 它的曲线却都会呈现有点弯弯曲曲
不是像普通别人的图那样 可以很平稳的上昇
我有打电话给那家公司
他们是说我加入的probe浓度可能太高
所以 我也有做了5x 10x 100x 1000x的序列稀释
5x结果是有比较好 但是还是会弯弯曲曲的
後来 我想过是不是我一开始用TE去溶解probe的原因
所以 将probe的stock 拿水稀释重做
情况也没有改善
第三次 使用经PAGE纯化过的primer去跑
其实本来就应该用比较高品质的去跑
只是之前用光了 所以後来定新的primer
跑过後 也有好一点 但弯弯曲曲的情况还是有
我不太清楚是哪种原因
曾经想过 我技术不好
或者是那间公司probe没做好(好像是新代理的公司)
或者是本身probe-primer就设计不良?
另外 我都有做过只放probe对照组
发现它萤光量 一开始就十万多 之後才慢慢降
因此 才会想过是probe的原因
请问大家有这种经验吗@@?
实验试过各种方法 却一直没办法做好
谢谢解答^^
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※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 220.139.214.163
1F：推 qqo8855436:是 abi roch biorad 哪一家的?? 12/12 18:44
2F：→ sinlu:ABI的 12/13 12:09
3F：推 qqo8855436:他们taqman分析不是看颜色吗?? 为什麽要看曲线?? 12/13 23:51
4F：→ sinlu:要看萤光量增幅的曲线@@ 我都是看这个 跟萤光上升的量 12/14 23:49
5F：推 qqo8855436:你是要定量还是分型的勒?? 12/15 02:35
6F：→ sinlu:定量的为主吧@@ 主要是侦测它在植物内含量的多少 12/15 23:47
7F：推 qqo8855436:方便的话贴图档我还蛮想看到他是怎麽歪的 ^^" 12/16 01:41
8F：推 wa478478:贴图...想像太模糊啦..... 12/21 13:23