※ 引述《bluehttp (虾毁)》之铭言： : 最近在做cloning, : 做到快发疯了. : 我用 XhoI 及 Hind III (biolabs), : 去切 insert 和 vector, : 跑电泳也确定有切动, : 之後用T4 DNA ligase 进行 ligation, 然後overnight, : 隔天再transform (DH5a),recovery 1hr,涂plate, overnight. : 可是隔天来看没有长..... : 我有试过用 fermentas 的 ligase 及 biolabs 的 ligase, : 可是一样都没长, : 不知道尚有哪些细节我没注意到, : 希望有经验的大大可以帮助我阿! 以uncut plasmid transform有长 表示plate跟competent cell没问题 你的问题听起来像是 ligation 失败 可能的原因有很多 可以 google "ligation troubleshooting" 有很多资料 如果是 "完全没长" 比较 major 的 1. ligase 或是 ligation buffer 坏掉 (ligation buffer含ATP要随时放在冰上) 2. agarose 为 ligase inhibitor 如果没弄乾净会影响 ligation 效率 比较 minor 的 3. ligase 没有 65度 inactivate 会影响 transformation 效率 4. 碰到过浓的 EtBr 或是染太久 会影响 ligation 效率 5. insert/vector 比例 --

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