作者wensing (潜力股)
看板Biotech
标题Re: [求救] cloning 救郎喔~~
时间Wed Dec 12 02:30:09 2007
※ 引述《bluehttp (虾毁)》之铭言：
: 最近在做cloning,
: 做到快发疯了.
: 我用 XhoI 及 Hind III (biolabs),
: 去切 insert 和 vector,
: 跑电泳也确定有切动,
: 之後用T4 DNA ligase 进行 ligation, 然後overnight,
: 隔天再transform (DH5a),recovery 1hr,涂plate, overnight.
: 可是隔天来看没有长.....
: 我有试过用 fermentas 的 ligase 及 biolabs 的 ligase,
: 可是一样都没长,
: 不知道尚有哪些细节我没注意到,
: 希望有经验的大大可以帮助我阿!
1. 切的时候 是一起混切？ 还是先後切？
2. 切完後 再经胶体纯化後，DNA sample 是否还在？
3. ligation时，大小片段混合後，加入buffer前是否先45℃加热再冰浴？
全程是否冰浴操作？有没有再额外加入1mM ATP? 大小片段混合比例是否正确？
(po 一下 你的步骤)
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※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 124.8.73.77
※ 编辑: wensing 来自: 124.8.73.77 (12/12 02:36)
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