作者bluehttp (虾毁)
看板Biotech
标题Re: [求救] cloning 救郎喔~~
时间Wed Dec 12 10:23:11 2007
※ 引述《wensing (潜力股)》之铭言：
: ※ 引述《bluehttp (虾毁)》之铭言：
: : 最近在做cloning,
: : 做到快发疯了.
: : 我用 XhoI 及 Hind III (biolabs),
: : 去切 insert 和 vector,
: : 跑电泳也确定有切动,
: : 之後用T4 DNA ligase 进行 ligation, 然後overnight,
: : 隔天再transform (DH5a),recovery 1hr,涂plate, overnight.
: : 可是隔天来看没有长.....
: : 我有试过用 fermentas 的 ligase 及 biolabs 的 ligase,
: : 可是一样都没长,
: : 不知道尚有哪些细节我没注意到,
: : 希望有经验的大大可以帮助我阿!
: 1. 切的时候 是一起混切？ 还是先後切？
: 2. 切完後 再经胶体纯化後，DNA sample 是否还在？
: 3. ligation时，大小片段混合後，加入buffer前是否先45℃加热再冰浴？
^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^
这一步是为什麽? 完全不懂
: 全程是否冰浴操作？有没有再额外加入1mM ATP? 大小片段混合比例是否正确？
: (po 一下 你的步骤)
1.Hind III 及Xho I 一起切, 37度 overnight
2.run gel,gel extraction (bioman)
(在gel extraction後,我有跑电泳,确定DNA还在)
3.ligation,体积比insert/vector = 7:1
(我用的ligation buffer本身就含有 1mM ATP)
--
※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 123.192.24.108
1F：推 wensing:已回信！ 12/12 10:48
2F：推 bluecsky:我overnight都用4度C 12/12 12:54
3F：→ bluecsky:加热是因为BUFFER会有沉淀的关系吧 12/12 12:55
4F：推 jsi:ligation buffer含ATP 因此通常会分装成数管 避免多次解冻冷괠 12/12 22:23
5F：推 jsi:冻 导致ATP失去活性 而影响ligation进行 12/12 22:27