作者cothuho (cothuho)
看板Biotech
标题Re: [求救] cloning 救郎喔~~
时间Wed Dec 12 13:41:22 2007
※ 引述《bluehttp (虾毁)》之铭言：
: 最近在做cloning,
: 做到快发疯了.
: 我用 XhoI 及 Hind III (biolabs),
: 去切 insert 和 vector,
: 跑电泳也确定有切动,
: 之後用T4 DNA ligase 进行 ligation, 然後overnight,
: 隔天再transform (DH5a),recovery 1hr,涂plate, overnight.
: 可是隔天来看没有长.....
: 我有试过用 fermentas 的 ligase 及 biolabs 的 ligase,
: 可是一样都没长,
: 不知道尚有哪些细节我没注意到,
: 希望有经验的大大可以帮助我阿!
你的insertion 和vector长度比如何？
长度接近 且insertion较长时 也比较难ligate
另外 你的vector有没有放够量
至少也要100ng 比较保险
别只看胶上跑的粗细来判定 去测测浓度吧
DH5a细胞数不要太高 会影响transformation
若要涂的细胞有点多 涂到两个plate上 以免死亡的细胞抑制resisitent的细胞
另外vector有去磷酸化吗？ 试试看不要做去磷酸
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※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 24.145.137.213
1F：→ bluehttp:请问磷酸化的意义 12/12 19:54
2F：推 gloclovlo:应该是指vector做TSAP处理吧 12/12 20:15
3F：推 wensing:应该是insert 要 磷酸化 保护，避免转入後，被菌吃分解 12/12 20:57
4F：推 enisx:楼上你确定你讲这样对吗? 12/12 21:11
5F：推 wensing:抱歉，我一时想错了！ 是 甲基化 12/13 01:28