※ 引述《wensing (潜力股)》之铭言： : ※ 引述《bluehttp (虾毁)》之铭言： : : 最近在做cloning, : : 做到快发疯了. : : 我用 XhoI 及 Hind III (biolabs), : : 去切 insert 和 vector, : : 跑电泳也确定有切动, : : 之後用T4 DNA ligase 进行 ligation, 然後overnight, : : 隔天再transform (DH5a),recovery 1hr,涂plate, overnight. : : 可是隔天来看没有长..... : : 我有试过用 fermentas 的 ligase 及 biolabs 的 ligase, : : 可是一样都没长, : : 不知道尚有哪些细节我没注意到, : : 希望有经验的大大可以帮助我阿! : 1. 切的时候 是一起混切？ 还是先後切？ : 2. 切完後 再经胶体纯化後，DNA sample 是否还在？ : 3. ligation时，大小片段混合後，加入buffer前是否先45℃加热再冰浴？ : 全程是否冰浴操作？有没有再额外加入1mM ATP? 大小片段混合比例是否正确？ : (po 一下 你的步骤) XhoI跟HindIII是可以合切的 用2号的样子 虽然我是比较喜欢先後切 切完後胶回收 然後胶回收的产物回溶後取等量下去跑一片胶 再依band的亮度决定ligation的vector:insert 我习惯是... vector跟insert的亮度去除以长度得到莫耳比 vector:insert 最好是1:3~5 例如 　　　Ｖ　　：　　Ｉ 亮度　１　　：　　１ ---------------------------- 长度　５　　：　　１　　 这时候代表胶回收的产物浓度vector:insert大概是1:5 所以直接取1:1体积的vector跟insert下去ligation ligation时先将二次水 vector insert加热45℃ 5分钟 於冰上待凉後 加入ligase跟buffer 这里要注意buffer ligase buffer会有ATP在里面 通常存於-20时会有白色沉淀 使用时务必要把白色沉淀溶解 (用震的) (我记得这是ATP的沉淀...好像有点怪...) 之所以会有额外加ATP也是这个考量...怕没溶或degrade... --

※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc) ◆ From: 140.120.208.5 那时候翻Molecular clone是说37℃ 5~10分钟 详细原因我倒是不知道 後来实验室的protocal就被改成45℃ 也没有原因....@@... ※ 编辑: greenmoon00 来自: 140.120.208.3 (12/14 14:00)