作者seal0413 (seal)
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标题Re: [求救＞＞为什麽用pCRII-TOPO cloning vector꘠…
时间Thu Dec 20 13:15:05 2007
※ 引述《bluecsky (我要蓝蓝淡淡的天空)》之铭言：
: ※ 引述《seal0413 (seal)》之铭言：
: : pCRII-TOPO听说是最好接也较贵的cloning系统
: : 我的pcr product 大约 140bp左右
: : 我挑蓝白有挑到
: : 抽plasmid 也有比vector高一点(我跑胶跑0.8%且第一条DYE跳海後又多跑一下)
: : 只是去切enzyme ECO1(VECTOR上的)
: : 就怎样也切不出 140bp左右的位置
: : 请各位有用过TOPO的大大帮忙
: : 感谢不尽^^
: 这个TA kit我有用过
: 我都是直接拿M13 forward primer + insert forward primer跟
: M13 reverse primer + insert forward primer(因为有正接跟反接)
: 直接做PCR screening
: 然後就把positive的抓去送定序了
: 至於跑gel的话..没记错的话
: TOPO约5.7k..你才多140bp..要明显的分出来好像有点难
: 然後如果你真的想要明显看到有140bp的话
: 建议把gel浓度提高到3%以上(我会跑6%的拉XD)..这样100多bp的都可以很明显的看到
感谢你的意见
只是如果切不下来
那後续实验可能就不能做了
我挑几个有跳高的(约35个)
通通切不动
可是明明就比vector高><"
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※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 140.128.140.71
1F：推 blence:除了没看到140bp，你怎麽证明是切不下来？或是切不动？ 12/20 14:46
2F：推 shunze:定序结果 应该跟原先设计的做比较确认 12/20 21:07
3F：→ shunze:此外 再重新调整PCR的 condiction 重新P 重新接 12/20 21:08
4F：→ shunze:我也用这个做过150bp左右的片段 还外加切位 2周内就OK了 12/20 21:10