※ 引述《siberianiris (紫色鸢尾花~)》之铭言： : 请问各位有在做EMSA的大大们 : 我用Roche DIG的系统 自己label的probe大约150bp : (这段序列缺少 在我报导基因的数据中 是活性下降最多的一段) : (用这段去做EMSA 有看到binding band 而且加unlabel 也能被竞争) : 所以我去预测上面的TF结合位 然後合成几组短短的oligonucleotide : annealing後 在binding的反应中 分别加进去当作competitor probe : lane 1: DIG-probe(150bp) only : lane 2: DIG-probe + nuclear extract : lane 3: DIG-probe + nuclear extract + competitor probe(没有label) : . : . : . : lane X: DIG-probe + nuclear extract + competitor probe X (没有label) : 结果出来 原本lane 2有band的地方 在加入X後 band就消失了 : 显示 X的序列 好像是band 结合的主要位置 : 於是我将X的序列 做了点突变 然後照样合成短短的 competitor probe X mut : 再做一次EMSA 发现lane 2的band又出现了 : (也就是lane 2 有band ; 加X後 band消失 ; 加X mut band又出现) : 那麽请问一下 如果做到这边 能否代表 X 就是调控这段活性主要的TF ??? : 将来如果去做 X 点突变的reporter construct 那活性是不是就会下降?? : 诚心请问有相关经验的人 能分享一下 : (>_<非常紧张这结果代表的意思 到了睡不着觉的地步了 T_T) : 此外, 我跑出来的band 看起来都糊糊的 沙沙的感觉 @@ : 不知道是哪边的问题呢？ : 先谢谢大家看完 ^^ 回答最後一段 嗯~其实band看起来就是糊糊的 重点是有多糊XD 建议是做EMSA最好有独立的一套器具不要混用 DNA-protein在EMSA的binding真的是很弱 所以该做的保护请多做好吧 以kit来说 所提供的control应该是可以做的跟厂商说的一样sharp才对 --

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