※ 引述《yingchi (脑残无极限)》之铭言： : oopa: 如果方便可以提供你是用哪种组织及blocking的条件,会比较 12/27 : oopa: 容易找问题,或许有些人有类似的经验 : oopa: background可能来自组织本身的biotin,此时就要从blocking着手 : everything47: 你的组织本身就有颜色吗? 会不会是过染了? : everything47: 如果是过染 把一抗的比例调低试试 : roddic: 你有做antigen unmasking吗? : ------------------------------------------------------------------------ : 真的感谢各位前辈的指教， : 我用的是心脏组织，目前blocking的条件是1%的PBA於室温下一小时， : 而且另外在一抗前，还用一个comercial的power blocking reagent做blocking， : 至於组织本身颜色的问题，心脏组织我目前染的感觉，在萤光显微镜下， : 不同滤镜片，也会呈现不同颜色， : 至於在光学显微镜下，我到觉得没啥颜色就是， : biotin的问题，其实我不太懂，但是该做的步骤我都有， : 像是H202的quench，这方面我不熟悉，所以我不知道会不会有什麽影响 做DAB呈色 用H2O2以去除内生性的proxidase是很重要的 但是如果是做萤光染色 这各步骤可以省略 还有 可以试试看用 H2O2的步骤 最後反应用萤光呈色 再利用Roche的 Conver-POD 就可以针对 FITC的萤光在接合後 用DAB呈色 这各我以前也有玩过 至少一个片子 可以看到两种效果 (不过 只可针对用FITC的) : 另外，antigen unmasking我是有做的，我是以10mM的sodium citrate， : 以隔水加热法，於沸水中作用20分钟， Sodium citrate我习惯用 fresh的 (还得要调pH值) 不过因为我都是做冷冻切片 这各步骤就不一定要做 : 不过冷却的动作我倒是挺随性，煮完我就直接泡在PBS了，不知道这样会不会有影响 : 过染的问题，我比较好奇的是，各位前辈在做DAB染色时， : 当加入DAB reagent後，都可以在30秒内， : 整个组织切片，会用肉眼就可以看到明显的变成红褐色吗？ : 因为我目前有这样的状况。 : 抱歉，叙述的不是很好，不知道各位前辈在做DAB时， : 最後在染核时，是用什麽染剂， : 以及染完後，是否整个组织颜色都会变成此染剂的背景色 : 谢谢各位喔 m(_ _)m 有时候DAB染的过度 会造成很强的背景 所以 当在做DAB反应的时候 可以准备一台显微镜 将确定会有反应的片子 或是有做 postive control的片子 滴上DAB反应剂 观测看看 预期可能反应的细胞 或 组织 是否有反应的细胞 终止反应就将片子放在TBS中(or PBS) 通常我都是以观察大约数片 之後决定所有片子的反应时间 最短的 30秒都有可能 而且老师很挑剔的要看到 背景乾乾净净 细胞反应很明显的对比 之後如果再做对比染色就相对的比较容易做出差异性的区别 再退染时 我也都会用显微镜观察 是否有达到我要看到核有染上色 但细胞质没有 (酒精退色的时候要注意看) 最好是细胞核就深深的蓝色 而细胞质是透明的 虽然说起来很简单 但是 我知道 会手忙脚乱 因为我一开始常常就是把片子染DAB 老板对着我说 "你的组织切片 是被你用火烧过吗?!" 再来是对比染色时 老板会说 你是染细胞核还是整各细胞质啊?! 此外 在不同组织块 得要挑选适合的染剂作对比染色 像 brain 用 Hematoxylin 很不容易染上色 可换用 Nissl stain 会很明显的看到neuron 的细胞核 不过 大部分采用 Hematoxylin 即可 ---- 目前想到这样 很多小细节吧 @.@ --

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