作者reteporeh (台风也喜欢放假)
看板Biotech
标题Re: 切胶回收做PCR
时间Sun Jan 6 22:51:11 2008
谢谢大家的回覆
因为我目前的问题在於说切胶回收後的产物无法再次PCR出来
而第一次PCR的产物跑胶是有major band的
只是将major band切胶回收後
再次PCR完後,跑胶却跟L大的情形一样
没有band的出现
所以我想要知道的是否在回收的产物
再次进行PCR是否有什麽地方要特别注意的
ps..而s大所说的情形似乎跟我的有点不太一样,所以那些因素应该都可以初步排除
※ 引述《sGoat (无三小羚羊)》之铭言：
: ※ 引述《reteporeh (台风也喜欢放假)》之铭言：
: : 想请问板上的各位
: : 有将PCR产物做胶回收然後再进行PCR吗?
: : 目前遇到的情形是
: : 胶回收完的产物再进行相同条件PCR时
: : 在跑胶确认时,没有看到任何的band
: : 重复做过几次,情形依然
: : 想请问在做完胶回收後
: : 再进行PCR时
: : 有什麽条件特别要求的吗?
: : PS..胶回收是使用Kit做的
: sorry...
: 我的意思是为什麽要在PCR完之後跑胶回收"再跑一次PCR"...
: (胶体回收也要看的到产物在哪里吧?纯粹猜测位置再切胶回收要是没产物不就做白工?)
: 假使你的primer设计得够专一的话...
: 单纯考虑扩增量不够...
: 将你的PCR产物稀释50倍之後再以同一组primer进行PCR扩增...
: (甚至是使用更专一的Nest primer扩增)
: 就能将你第一次没被放大到可见程度的产物再放大一次...
: 一直持续到你所要的产物被放大到你要的量...
: 假设是扩增要进行ligation的片段...
: 那你的RE切位一定设计在primer上...
: (此句修正,要外加切位才是在primer上)
: 在没有产物的情形下,为何不先考虑PCR是否成功?
: 再假设你进行了PCR扩增ligation的片段...
: 你得到了产物,你将产物以RE切过了
: 跑了胶回收完,你想要确认回收到的是不是你要的片段...
: 因此以相同的primer又跑了PCR想说要是同样的东西应该有东西会P出来...
: 可是你的template上primer相对应的黏接位置已经被你用RE切掉了...
: 那你怎麽能够预期PCR能够P出东西来呢?
--
※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 220.129.166.142
1F：推 tsubasawolfy:不太懂为何要再PCR一次 01/06 23:21
2F：推 NKTcell:再跑没band的话 可以将胶纯化的DNA直接跑胶试试看 看是否 01/07 08:05
3F：→ NKTcell:有纯化成功 如果是PCR方面的问题 p的时候记得要另外加dNTP 01/07 08:07
4F：→ NKTcell:也要记得做不同倍的dilute 以免跑出来都是smear 01/07 08:08
5F：推 sGoat:有没有考虑过P出来的band不是你要的产物? 01/07 11:29
6F：→ reteporeh:恩恩..有这样想过..但是很奇怪的是回收再跑PCR就没有 01/07 18:57
7F：→ reteporeh:但是不回收将PCR产物取出一点点,再跑PCR就有band了= = 01/07 18:58
8F：→ reteporeh:回N大,回收後跑胶是有band的,PCR也是有另外加dNTP的 01/07 19:00
9F：推 sGoat:试试将回收的DNA跑胶看看有没有回收成功,或是偷懒的测一下 01/07 21:47
10F：→ sGoat:DNA浓度,先看回收有无成功,若没有成功,考虑DNA可能留在kit的 01/07 21:50
11F：→ sGoat:膜上,这时候考虑的是药物PH值对不对,还有回收片段的大小 01/07 21:52
12F：→ sGoat:我之前用的回收kit有说大於2K以上的片段回收需要不同方法 01/07 21:53
13F：→ sGoat:至於详细内容忘了=.= ,不知道你是不是在clone,因为我之前有 01/07 21:55
14F：→ sGoat:这种情形. 稀释有出来回收没出来,其中差别在你稀释的里面有 01/07 21:57
15F：→ sGoat:你第一次跑的原始template,回收则只有你挖的band,参考一下.. 01/07 21:59
16F：推 sGoat:如果後续动作要定序,你钱满多的话...定一根吧XD(可能会被杀) 01/07 22:04