※ 引述《annesamuel (as)》之铭言： : ※ 引述《annesamuel (as)》之铭言： : : 我的sample跑出还的长度大约 0.5Kb : : 如果annealing temp 提高 negative control 的band就不见了 : : 但我的sample跑出来的量就非常少非常少 : : 有的sample甚至跑不出来 : : primer dimer的可能性也有考虑过 : : 也有请我学妹做 结果也是一样 : Negative control 的水是用0.2micrometer滤纸过滤再灭菌的二次水 : 引子 (primer) : Forward --- 968fgc序列 ： 5’-CGC CCG GGG CGC GCC CCG GGC GGG : GCG GGG GCA CGG GGG G : AACGCGAAGAACCTTAC-3’ : （with GC clamp） : Reverse ---1401r序列 ： 5’-ATTACCGCGGCTGCTGG-3' : primer dimer 应该不会0.5Kb 这麽大吧 你的forward会形成几个不容易解开的hairpin... reverse倒是不错... 对於你0.5k的band我想可能是你forward的hairpin造成的... 自己黏自己就形成template跟primer了(爆) 因为你在文中有提到将温度提高就不会出现... 但是因为你提高的温度可能造成你reverse的primer黏不上去... 所以提高温度的作不出来... 所以我的建议是... 如果你能确定产物哪个是你要的,而且这个过程不需要漂亮的电泳图的话... 就挖你要的东西出来用就好了... (或是缩短anneal时间,或是加入DMSO解开二级结构,参阅5622推文的sil大) 或是将你提高anneal温度的PCR条件增加cycle数(不要超过总数35cycle)... 再做不出来就把你P完第一次的产物稀释5-50倍当作template再进行PCR一次... 条件跟第一次一模一样,也是要用提高anneal温度的条件做,当然premix都要加... 再来是龟毛的解决办法... 将你的forward缩短,尽量使它跟reverse的条件一样... GC值,Tm温度,长度,其中又以Tm温度最重要(其他作参考)... 再将设计好的primer用DNAStar或是DNAMAN这类软体计算dimer与hairpin... 尽量取最好的一组使用... 反之...要是你的forward是不能变更的话,请加长reverse... 还有更龟毛的是你以上方法都试不出来时可以用的... 不过这个还是等你都用不出来再跟我问吧... 希望有帮上忙... --

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