作者cyken (Ken)
看板Biotech
标题Re: [求救] Cloning 的问题
时间Tue Jan 22 00:18:45 2008
※ 引述《canongirl (变 世上唯一不变)》之铭言：
: 大家好，目前我手上有一个clone 要做
: 老师请我先去合两条primers 有53mer
: 序列(举例)： primer1：5'ATCGCGTGATATGTGCTCATAGCT...3'
: primer2：5'TAGCGCACTATACACGAGTATCGA...3'
: 也就是两条完全pair，因为这53mer其中包含我要clone的insert 另外有两端各有BamHI
: 的切位可以接在vector上
请你仔细看一下, 你上面设计的primer根本无法正确地如你希望地 anneal
正确的primer应该要互为 reverse complement
primer1：5'ATCGCGTGATATGTGCTCATAGCT...3'
primer2：
3'TAGCGCACTATACACGAGTATCGA...
5'
若要设计两端为 BamHI , 并不需要用到BamHI去切
你可以设计成这样
primer1：5'
GATCCATCGCGTGATATGTGCTCATAGCT...
G 3'
primer2：
3' GTAGCGCACTATACACGAGTATCGA...
CCTAG 5'
接下的实验步骤给你参考一下,这是我常用的方法:
** 方便起见 microM 表示为 uM , microliter表示为 uL **
1. primer稀释成 10 uM的浓度
2. PNK reaction: (用500uL或200uL的eppendorf)
primer1 (10 uM) 1 uL
primer1 (10 uM) 1 uL
PNK buffer (10X) 1 uL
ATP (10 mM) 1 uL
T4 PNK (? units) 1 uL *随厂牌不同,活性单位会有不同算法和浓度
通常不会特别去精算用量,直接加 1 uL
dd water 5 uL
----------------------------
Incubate at 37度C , 1 hour
3. PNK之後,直接拿去做anneal,最方便的方法是用PCR machine,
所以PNK的时候用500uL或200uL的 PCR eppendorf,就可以直接上机
设定你的PCR machine:
95C,5min -> 65C,5min -> 45C,5min -> 25C,收
4. 切你的 vector DNA, 例如你这边用的 BamHI,
只切一个enzyme的话,记得要再做 CIP,以免 self-ligation
然後run agarose gel纯化 DNA
这一个步骤其实跟一般的cloning都一样,有问题的话向实验室学长姐或老师请教
5. Ligation :
PNK并anneal之後的DNA不需要纯化,可以直接拿来做ligation
vector DNA ~100 nanogram
annealed primer 1 uL
ligase buffer xx uL
T4 DNA ligase x uL
dd water xx uL
这个步骤就跟一般的ligation一样, 实际反应体积就看你的vector DNA浓度来调整
ligation的温度和时间各家作法不一,用你习惯的方法去做就好
===================================
以上献丑了, 欢迎各位板友的批评与指教。
--
※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 140.109.169.106
1F：→ cyken:补充:尽量不要用单一个RE做 cloning 01/22 00:45
2F：→ cyken:容易发生self-ligation,反向insert,和多重insert 01/22 00:47
3F：推 bluecsky:没错..单一RE site cloning麻烦多多.. 01/22 04:18
※ 编辑: cyken 来自: 140.109.32.9 (01/22 14:02)
4F：→ cyken:今天算了一下浓度,insert浓度太高,所以修了文 01/22 14:02
5F：→ cyken:100uM -> 10uM ; 95C10min -> 95C5min ; insert 2uL -> 1 uL 01/22 14:03
6F：→ cyken:100uM是我在做 3-piece ligation 用的浓度 01/22 14:04