作者bluecsky (我要蓝蓝淡淡的天空)
看板Biotech
标题Re: [问题] TOPO cloning
时间Wed Jan 23 08:15:07 2008
※ 引述《ad1980 (Apoptosis)》之铭言：
: 之前有问过 TOPO 的问题，
: 现在又有了，想问问看有没有人知道。
: 就是阿... 我把 pcr 接到 Topo vecter 上之後，
: transform 到 E. coli 里。
: 但是呢... 隔天出来的 colonies 几乎都是 template vector...
: 明明就只有用一点点做 pcr, 接的时候也只拿 pcr product 的 2ul/50ul,
: template 的量应该是少得可怜，
: 可是 transformation 出来，存活的 colonies 都是 template。
: (很不幸我的 template 跟 Topo vector 一样都是 Kan resistent)
: 我 labmate 的问题也是一样，
: 最後他的解决办法就是把要 pcr 片段从 template vector 切下来，
: 再用那个片段去 pcr 才解决这个问题，
: 可是这样很麻烦，难道每次用 Topo 都要这样吗？
: 有没有人遇过同样的问题，或是知道为什麽会出现这种情形。
: 为什麽 bacteria 那麽喜欢 template vector,
: or 那麽讨厌 topo vector？
: 感谢。
这问题很好解决...多一点点步骤而已
你就把PCR product拿去跑gel 再切gel上的band来纯化
就可以做好了..当然你要先切下再跑PCR也一样
虽然麻烦但是没办法..因为这种vector转入的效率本来就比较好
加上如果你用的是一整套TOPO kit..里面附的comptent cell效率又更高
至於为啥更爱这vector?..原因很多阿..可能你TOPO vector比他大
比较小的vector会比较好转..又或者是你TOPO接的效率不够高
by the way..这种纯的vector大多只要用不到0.1 ul就可以转出一大堆了..
--
※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 59.112.214.105
1F：推 shunze:那为何不用另一种抗生素筛选?我记得TOPO有两个 01/23 09:49
2F：→ bluecsky:我用的TOPO是有amp跟kan这两种.. 01/23 11:56
3F：推 ad1980:我 labmate 试过拿 pcr 去 gel extract，结果一样，所以 01/23 11:58
4F：→ ad1980:她才试把片断先切下来，主要是要让 temlate 没办法存活 01/23 11:59
5F：→ ad1980:我们实验室用的只有 kan 而以... 01/23 12:01
6F：→ ad1980:可是我之前用 pGEM-T system 都没有这种情形耶... 01/23 12:04
7F：→ ad1980:我的 template 比较大，快 8kb... 01/23 12:04
8F：→ ad1980:我们是用一整套的，不是少少几颗，就是很多但都是 template 01/23 12:05
9F：→ ad1980:才想说 Topo 跟其他比起来那麽不受 cell 欢迎阿？？ 01/23 12:07
10F：推 MrCAKE:在原本template上的抗生素基因中间切一刀如何 01/23 13:03
11F：推 ad1980:to 楼上：对厚... i will try it tomorrow~ 01/24 09:40