作者cloneting (1ting)
看板Biotech
标题Re: [求救] 做了好多遍的clone，就是接不上去，why?
时间Wed Jan 23 20:57:19 2008
※ 引述《bluecsky (我要蓝蓝淡淡的天空)》之铭言：
: ※ 引述《kutoushinji (所有人都跟我犯冲吗?)》之铭言：
: : 酵素切位是我设计的
: : 一个是平头的一个是sticky的
: : 好的，我今天试试看换新的buffer
: : 我们家都是分装的，可能是我的buffer坏掉了
: clone的切位能不用blunt end就不要用blunt end
: 假如你的buffer没问题的话
: 你可以试试让他ligation更久一点
: 我试过4度C放个三天..效果还不错
: 最快的方法还是重新设计一个primer改成两端都是sticky end..
: 这样也不一定要在做一次TA..你可以把这次的plasmid当作template
: 然後做PCR直接拿product去用..
: 总之有blunt end就是麻烦啦...
blunt end 没有那麽难接啦
insert & vector处理好坏是关键
限制酶量及作用时间参考酵素说明书
两种酵素是否可以一起切也是关键之一
NEB网站上有蛮多资料可以参考
如果需要挖胶纯化 动作尽可能快不要在UV box上太久
ligation 室温2小时效果就不错
heat shock後加SOC比用LB 转形率好很多
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※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 140.112.74.19
1F：推 bluecsky:哈..我只是有过不好的经验所以很怕这种的cloning 01/23 22:18
2F：→ bluecsky:不过说真的做久了就觉得条件都没有一定啦..凭直觉XDD 01/23 22:18