作者arzakiii (Isopotenal)
看板Biotech
标题Re: [求救] 抽RNA定量问题
时间Tue Jan 29 02:33:49 2008
※ 引述《qkenny (想变白的巧克力)》之铭言：
: 请问一下
: 一般细胞是抽完RNA然後定几个microgram下去做RT?
一般做RT都是买kit来做
kit上面都有很详细的说明
您看上面一定有讲说跑RT您所需要加入的浓度是多少
: 还有若是有感染RNA病毒的细胞
: 在测吸光值的时候 RNA量会特别高
: 那定RNA总量下去跑
细胞被病毒infect以後分两种途径
一种是病毒会拼命的让细胞制造病毒
这样细胞的RNA的浓度当然会上升
不跑RT只做定量的话
只能证明说你的病毒可能真的有infect细胞
: 例如:定2 microgram total RNA 若测吸光值为6000ng/ microL
: 一般细胞没感染的话在1000多
: 那不是细胞的RNA相对变少
: 是不是就不能用actin去定量?
: 那有什麽定量的方法?
: 谢谢
actin是housekeeping geen
基本上不管病毒有没有infect应该都是固定量
所以才会常被用来做interal control
当然可能有少数会影响actin的病毒
如果您的病毒前人已经有做过
可以自己去查一下reference
如果没人做过
用RT测试一下就知道您的actin有没有被影响噜!!
定量的话我都是用spectrophotometer
我是没用到actin
用到actin通常是跑胶才会用到
如果纯粹只是要定total RNA只需要用spectrophotometer
就行啦!!
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※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 220.139.74.41
1F：推 lanth:不同的细胞种类用不同的internal control 01/29 09:33
2F：→ lanth:例如肝脏再生时常用是beta2 microtubulin 而不能用其他的 01/29 09:33
3F：→ lanth:所以要选一个大家认可表现量不会改变的 比较适合 01/29 09:34
4F：推 qkenny:谢谢 我是想说若有细胞株对病毒感受性不同 要怎样做出来的 01/29 20:47
5F：→ qkenny:图 PCR後 可以看到actin的band量相同 而病毒的band量不同 01/29 20:50
6F：推 qkenny:所以想问抽RNA 後要怎样定量做cDNA 跑PCR才有那样的结果 01/29 20:54
7F：推 lanth:要不要试试看不要管actin,DNase处理後的RNA拿去测吸光值 01/30 08:39
8F：→ lanth:再跑胶确定浓度真的调整成一致 然後再转cDNA 01/30 08:40
9F：→ lanth:建议不用actin的原因是说不定病毒感染会改变actin表现量 01/30 08:42
10F：→ lanth:而且细胞株不同 actin的表现量应该会有所差异 01/30 08:44