作者kvw (Je t'aime)
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标题[求救] 有人做过5' RACE PCR吗?
时间Mon Mar 3 12:15:02 2008
最近在做5' RACE PCR
用的是Roche 5'/3' RACE kit
我先用一个reverse primer 1 (R1)将RNA转成cDNA後
再让cDNA接上poly A tail
之後再用oligo-dT anchor primer与reverse primer 1(R1) and 2(R2)去做PCR
结果到这边只有出现primer dimer
之後老板要我再做一次nested PCR
就是用PCR anchor primer与reverse primer 2 (R2)去跑
结果反而出现smear的现象
第一次的PCR product也照kit protocol写的做了1:20倍的稀释
还是一样出现smear的情形
请问一下有人做到5' RACE PCR吗?
实在不懂哪里出了问题 是RNA转cDNA部分没做好吗?
因为原本怀疑是在cDNA接上poly A tail这边的问题
结果重新做了一次还是一样
kit上面说可以直接用oligo-dT anchor primer与reverse primer 2
就可以直接夹到所要的片段 真的可以这样就做出来吗?
我们家老板说不可能 那这样还要anchor primer干麻
拜托有没有做过5' RACE PCR的人可以帮我一下 谢谢~
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◆ From: 192.192.90.35
1F：推 Meshif:smear没关系 用下一组primer照P就对了 03/03 14:29
2F：推 Meshif:用anchor primer加上reverse primer 3再P一次 03/03 14:35
3F：推 feng760804:SMEAR有时候是正常的..你要不要把最後72度的时间拉长? 03/04 15:58