作者kvw (Je t'aime)
看板Biotech
标题[求救] 有关cloning的问题
时间Fri Mar 14 00:56:11 2008
最近在做cloning
所要insert进去的片段大概是1700 bp
所使用的是p-GEMT easy vector
前面都很顺利
後来挑了white colony
抽plasmid後 用PCR做confirm(老板说这样比较省钱)
结果出来 完全没有insert
初步排除是X-Gal出问题
因为有蓝有白还蛮多的
而其他inser进去的片段是400 bp的都成功
唯独这个大片段的 挑了快20个white colony都没有insert进去
有没有人遇到这样的情形 拜托帮帮忙
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※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 192.192.90.48
1F：→ chvkimo:再多挑一些看看吧 03/14 01:44
2F：推 bluecsky:这套我用过也做过2k左右的insert..有一些小诀窍 03/14 08:44
3F：→ bluecsky:例如放到4度冰箱冰一个小时加强表现 03/14 08:44
4F：→ bluecsky:或是可以延长一点ligation的时间 03/14 08:46
5F：→ bluecsky:还有挑的时候可以再拿更多colony..反正是跑PCR 03/14 08:46
6F：→ bluecsky:看看那精美的96孔盘...你知道我的意思吧 03/14 08:47
7F：推 enisx:为何不直接作coloy PCR? 另外 ligation放室温 o/n 试试 03/14 09:46
8F：→ enisx:另外 楼上说的对,一次挑 就挑96个,多挑个几盘总会有一两个! 03/14 09:48
9F：推 bluecsky:楼上没说我还没发现他是抽plasmid做PCR.. 03/14 10:01
10F：→ bluecsky:做colony PCR就好了..比较方便 03/14 10:01
11F：推 oplz:有做 PCR positive control 吗? 03/14 11:39
12F：→ kvw:已经有放在冰箱快3小时了~蓝白还蛮明显的~ 03/14 12:08
13F：→ kvw:没有做positive control 不过其他盘都是有出现insert成功 03/14 12:08
14F：→ kvw:大家都建议挑多一点 可是今天又再挑了快12个 还是没有~ 03/14 12:09
15F：→ kvw:老板说这样太不划算了 要看看问题在哪再做 实在很苦恼 03/14 12:11
16F：推 dankai:换一个抗生素~~~ 03/14 13:12
17F：推 Janeliuu:Clone 到别的 plasmid 试试....不一定要用 pGemT 03/14 18:04
18F：推 enisx:挑12个就要有对的要蛮运气地~ 03/14 20:47
19F：推 bluecsky:怎麽会不划算呢..不要抽plasmid做colony PCR 03/15 07:46
20F：→ bluecsky:不用半天就能screen上百个colony..快又方便XD 03/15 07:47