※ 引述《aaada (rex)》之铭言： : ※ 引述《lblackpig (小黑猪)》之铭言： : : 我使用PCR的方式将目标基因p出来，将PCR product由gel纯化出来，再将其与T voector : : 进行ligate，并进行transform。结果可以长出蛮多的colony。接下来想要将其clone到 : : pEGFP-N1，使用enzyme将T vector上的gene切下并elute出来，同时也使用相同的enzyme : : 切pEGFP-N1 (不过可能两个切点太近，只有约4-50 bp，所以gel上并看不出 被切下来的band，也不太确定有没有切开） 针对这点 要不要查一下NEB的书 1. 看哪一个enzyme先切比较好 因为有的enzyme会需要旁边有n个nucleotide才切的动 2. 使用buffer浓度低的enzyme先切 将两者放在一起liagte，之後进行transform。 但是长出来的colony非常少，或者完全没有， (酵素切完应该有clean up 才做ligation齁?) 如同a大说的 抗生素有用对吗 若有用对 那你得到的colony应该就是你要的 否则就是 你的vector或insert没制作好 或是 ligation 条件不佳... (酵素切完应该有clean up 才做ligation齁?) 不管我的基因是600bp或1600bp，都是这样，各 : : 位有没有任何看法？为何这样的liagtion似乎好像效率不高？ : 有几各可能 你参考看看 : 先决条件是 vector and insert处理都没有问题 : 1.抗生素是否使用正确, pEGFP 记得是抗 kanamycin,不是常使用的Amp : 2.competent cell efficiency太低, 多挑几各或许可以挑到, : 或是换好一点的 competent cell --

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