※ 引述《cytospin (无心)》之铭言： : 请问一下比较好的Co-IP lysis buffer使用什麽比较好 : 现在我就是用普通的lysis buffer (Tris, NaCl, EDTA, 10%glyceral, 还有一堆inhibitor) : 可是做出来效果不是很好 : 想说会部会我的lysis buffer太强了 (我似乎有看到有人用tritonX-100做) : 把pt-pt interaction也都打破了 : 我的做法如下: : 1. 3x 10^7 cells lyzed in 500 ul lysis buffer, 4C, rock for 45 min : 2. Spin down 20 min : 3. sup preclean with Trueblot anti Rabbit beads 30 min : 4. Add 5 ug of primary Ab, 4C rock O/N : 5. add 50 ul beads 1hr, rock , 4C : 6. wash twice, : 7. add 2 X loading buffer , heat 10 min : 8. spindown, loading : hmm.....大概就是这个样子 : 请问Co-IP达人 : 有没有比较好的建议?? 你可以把你的lyse buffer每种成分的浓度PO一下嘛 像salt(NaCl)浓度在IP时会影响protein-protein interaction detergent也会 另外，lyse和IP时的浓度也会有差 如果你说你上述的NaCl和detergent都没有调很高 那可能就是lyse时你要的protein大部分没有溶出来 或是你的protein的sublocalization很多种(核内核外膜上) 以我的经验，NaCl一般都是用150-200mM即可 Tx-100用0.1或0.2都可以 不管lyse or IP都这样的condition即可 如果要看的CoIP条件是针对hydrophobic interaction而言 那可能还要再调整了 这是比较特别的例子^^ --

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