各位好 我做PCR大概也有数十次了 但有一些疑问让我蛮困惑的 一直不晓得如何去解释 因此希望能跟各位讨论看看 第一、 在一个可成功扩增的PCR反应中 如果把PCR的cycle数提高为什麽反而会使产物减少甚至消失？ cycle提高酵素活性降低、错误率提高、PCR达饱和我觉得都合理 但太高反而让产物降低我倒是怎麽想都觉得奇怪 是因为产物被降解？ 还是...（自己乱想的） 产物在多余的cycle中denature之後 因产物浓度太高而黏不回去或乱黏 使得major band变得不明显？ 第二、 PCR的产物究竟是否可以用"同一组"primer再扩增一次？ 我曾经这样做过 但会造成smear的现象 如果smear是因为受先前PCR reagent的影响 那我只要将产物稀释到适当的量 就可以再跑一次PCR？ 如果不行或效果不好 为什麽？ 我想nest PCR可以跑出更漂亮的结果 那为什麽同一组primer不行？ 有听过是因为primer binding的位置的说法 同一组的primer annealing的位置太靠近template的末端 所以不好进行PCR 这样的说法对吗@@? 第三、 关於3'RACE的问题 mRNA以poly d(T) primer进行RT之後的cDNA 应该用forward primer + poly d(T) primer就可以夹出片段吧？ 可是有人这样做出来过的吗？ 市售RACE kit使用anchor primer 是因为poly d(T) primer其Tm值太低的关系？ 以上几个粗浅的问题 希望有人能为我解答@@ --

※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc) ◆ From: 61.64.93.103 ※ 编辑: Fourfish 来自: 61.64.93.103 (03/30 15:52)