作者owl628 (owl628)
看板Biotech
标题[求救] 有关Southern blot的问题
时间Tue Apr 8 11:01:20 2008
小弟我是做yeast的
想用Southern blot去确定我knock out的gene的construct对不对
因为实验室没人会做 所以一切都自己摸索
但是碰到一些问题 希望板上的大大可以帮忙一下
我是用P32 label的
我的positive control也都有band
但是其他都完全看不到任何的band
所以我把我实验的流程PO出来 希望有做过的人可以指正一下
1.抽取yeast genomic DNA,取10ug用限制脢作用
(这里酵素的unit大概要加多少,我看过满多不同的版本)
2.把做用完的DNA跑胶,跑完後泡EB,照UV灯画marker
3.把胶依序用0.25N和0.5N NaOH&1.5N NaCl和3M NaCl&0.5M Tris-Cl pH=7
分别作用30分 60分 60分钟
4.做transfer o/n
5.将membrane做cross-linking(照UV)
6.pre-hybridization & hybridization
後面因为我positive control有band,所以不多加以叙述
不知道我这实验过程有哪可以改进或出错
因为我是实验室新手,可能犯了一些好笑的错误,希望大大多包涵
最後我想问一下,positive control大约加多少量比较合适
先谢谢愿意帮忙的板友,非常感谢你们^^
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◆ From: 140.128.139.218
1F：推 imeating:你用什麽当probe?是你要KO的基因还是selection marker 04/14 08:29
2F：→ owl628:我KO的基因上游+一部份KO的基因,约700多bp 04/16 00:14