作者nonononoy (...)
看板Biotech
标题[求救] IP和antibody的使用
时间Thu Apr 10 14:33:11 2008
这个实验我做很久了还是做不出来
希望有经验的大大可以给我建议，状况来了，请接招
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状况来了的分隔线 状况来了的分隔线 状况来了的分隔线
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我想要用western blot看一个endogenous的protein expression
不过这个protein目前市面上没有卖，所以我们lab由我来纯化蛋白(含HA-tag)
做出hybridoma之後拿去打老鼠，从其中腹水大量取得之後要用的ab
经过用western blot测试，我的ab是可以用在这个蛋白的侦测
因为这个protein在细胞中的表现量很低，一直没办法直接测到endogenous expression
所以老板建议我用IP-western的方法，也许可以得到结果
在还没开始进行实验前我想说先找到这个ab做IP最好的条件
所以我先做transient transfection，
positive control用anti-HA ab来做IP (5ul of ascites in 1 ml RIPA) O/N
我自己做的ab在一样的条件下也是加5ul做IP
western出来的结果是看不到我要的band，不过positive有出来
想说也许是epitope躲在内部，所以我也试过先denature protein再IP
不过还是得到一样的结果，各种IP的protocol我也试的差不多了
不知道各位有什麽建议?
为什麽western可以用的ab在IP就不能用了?
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※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 75.47.195.107
1F：推 oddball:我猜 因为western的ab是认直线状的peptide,可是IP要认的 04/10 15:37
2F：→ oddball:是conformation (native protein),所以才会有此差异 04/10 15:38
3F：推 aggaci:IP认的不一定是结构... 04/10 16:27
4F：推 leoblack:你的denature protein是怎样denature?!+2-ME?100度煮过?! 04/10 18:49
5F：推 chvkimo:你的immune用的protein是用peptide 还是 whole protein? 04/10 23:48
6F：→ nonononoy:我是有加2-me，也有煮，ab是用whole protein去制造的 04/11 02:25
7F：推 leoblack:恩~看起来会是同1楼说得那样~认的conformation不同,一个 04/12 11:47