※ 引述《Resd (遥远的未来)》之铭言： : ※ 引述《[email protected] (C'est)》之铭言： : : 我们实验室也是用结晶紫 : : 你可以把你作plaque assay步骤说出来给大家听 : : 这样我们也好提供意见给你 : 我上次做是fallow我找到的一篇论文 : 用6 well去做，cell先在6well中养一天， : 隔天加入不同倍数的病毒稀释液，37C感染两小时之後用PBS wash 三次。 : 然後加入含1% agarose,1ul/ml trypsin的medium 2ml perwell， : (用2%的agarose跟2倍浓度的medium做1:1稀释)。然後37度C倒置培养三天。 : 再加入1% agarose 跟0.1%neutral red 的PBS 0.5ml per well，37C 五小时之後观察。 : (这当中medium 加2ml是我自己试的，因为paper上没写该加多少 : 後面加0.5ml也是） : 之後我有问到另一个protocol : 不过因为不是很确定这当中的步骤 所以还没有做 : 另一个protocol如下： : （以下的步骤不是我写的，请不要引用，谢谢） : 1.病毒以汉克缓冲液 (Hank's solution) 做十倍连续稀释，由10-1稀释至10-7。 : 2.把单层细胞的上清液吸掉後，加上病毒稀释液0.05 ml，每一稀释液接种二个洞(well) : 并放置在37 ℃温箱一小时，其间每十五分钟摇动一次，使病毒可充分与细胞接触。 : 3.二倍的Eagles液与二倍高级琼脂等量混合，即成一倍的工作液，(Eagles 培养液放在 : 37 ℃水箱半小时) ，此时温度约为41℃，每一洞内加0.5ml。 : 4.放37 ℃温箱培养，并含二氧化碳2.5 %。 : 5.48～96小时，显微镜观察有CPE时，以10% 福马林固定液一滴加於一个洞中，过夜。 : 6.固定後之微量盘置於水龙头下，以水冲掉琼脂，倒放，使水份流乾。 : 7.以1 % 结晶紫染液二滴染色一分钟，再以自来水冲洗染液，直至无染料洗出为止。 : 8.自然乾燥後，便显出无色的不规则空洞。 : 我看不懂的是5～6的部分 : 步骤5，10%福马林加下去之後，agar会溶掉吗？还是会渗进去？ : 这时候应该是要放回37度C吧？ 那要倒放还是正放？ : 步骤6是我最困惑的地方，用水把agar冲掉，cell不会因此跟着被冲掉吗？ : 另外就是，这些含有病毒的东西，冲到水槽去会不会怎样？ : 请有经验的人帮我解答一下好吗？ 谢谢！ : 这个实验我实在是从来没做过，实验室也没有其他人在做 : 一切都是我用想像的然後去试试看 For plaque assays, confluent MDCK cell monolayers in 6-cm dishes were infected with 10-fold dilutions of recombinant viruses in a total volume of 1 ml of PBS–0.2% BSA for 1 h. Cells were washed with PBS–0.2% BSA and covered with an overlay of MEM containing 0.5% purified agar (Oxoid Ltd, Basingstoke,Hampshire, England), 0.02% BSA, and 0.001% DEAE -dextran. Cells were incubated at 37C under 5% CO2, and pl aques were stained 3 days postinfection with 0.1% crystal violet in a 10% formaldehyde solution. <出处> Interdependence of Hemagglutinin Glycosylation and Neuraminidase as Regulators of Influenza Virus Growth: a Study by Reverse Genetics <中文> 关键之处大概是在於 结晶紫是泡在福马林液里面 同时固定跟染色的 stained with 0.1% crystal violet in a 10% formaldehyde solution --

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