作者aggaci (小提琴的连弓真的好难阿)
看板Biotech
标题Re: 有关纯化的问题
时间Thu Apr 17 15:58:53 2008
※ 引述《aggaci (小提琴的连弓真的好难阿)》之铭言：
最近从pichia medium收集蛋白质
因为量太多了
所以我用80%的硫酸铵把它抓下来後
过nickle resin进行纯化
等到我觉得我洗的很乾净了，再以高浓度的imidazole 进行 elution
出来的都黄黄的，根据以前的经验，通常降子蛋白质都很多
但是以20 micrliter跑电泳只有一点点，没什麽杂蛋白
(western blot结果是有东西的)
後来拿去dialysis 颜色也没变淡.....
那颜色到底是什麽造成的？(浓缩後变成深咖啡色)
拿去用BCA测浓度 测出来有10mg/ml.........Orz..
拿来跑电泳根本没那麽多
因为我第一次做皮奇亚的实验，所以很多都不太懂
有没有高手能指导一下哩
谢谢
--
http://www.wretch.cc/blog/aggaci
--
※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 140.114.100.165
1F：推 Ren:probably contains metal(s). Use UV-VIS to test OD 300-500 04/17 02:16
直接测吗？不需要加任何reagent吗？
2F：推 ROKEE:这东西超臭的XDDD 原po原敲完硫铵、透析後有过mino-pore?? 04/17 07:52
3F：→ ROKEE:那些可能是代谢产物,毕竟这是可以长到OD600=200的菌 04/17 07:53
4F：→ ROKEE:而且产量不高的原因很多,medium.菌株.methonal诱导时间,etc. 04/17 07:55
5F：→ ROKEE:更正 mini-pore, methanol (烂键盘害我一直打错= = ) 04/17 07:56
请问你说的是过0.2 filter吗？
6F：推 pichia:当初transfromation时候 有用Zeocine挑表现量较高的菌株吗 04/17 11:37
我的vector是pPIC9，不是抗zeocine
当初有几颗都有表现(小量) 我是挑表现量最多的去大量表现
而且很多都在胞内....Orz..有种冲动想把他打破纯化...="=
7F：推 cypher0623:哇~ 本尊都推文了 04/17 12:49
--
http://www.wretch.cc/blog/aggaci
--
※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 140.114.100.165
8F：推 jjlee:打破纯化你会哭... 杂蛋白质多到要extra colunm来去除 04/17 21:13
9F：推 sqqs:分泌蛋白的glycosylation也要考虑 多年前我看过paper 04/17 23:51
10F：→ sqqs:有提到glycoprotein比较不易被comassive blue染出来... 04/17 23:54
11F：→ aggaci:真的吗？！？请问是哪一篇paper...?明天我来找找看，找不到 04/18 01:49
12F：→ aggaci:再请教你~~ 04/18 01:50