作者horacehu (on the road)
看板Biotech
标题[求救]关於liver tissue的IP
时间Mon Apr 21 23:47:11 2008
小弟最近要搞出个growth hormone在mouse liver造成STAT5 phosphorylation的实验,
方法大致是打growth hormone於小鼠腹腔,（处理不同时间）
牺牲後取liver用RIPA(含protease inhibitors)磨好,
然後用protein G beads preclean过,
用anti-STAT抗体去做IP,
再用anti-phosphoSTAT5去做IB,
无奈一直做不出来.
上述两只antibody都是santa cruz（弘晋）的, （我想大家都会会心一笑）
但在确定我sample preparation实验过程都是ok前,我不会轻易说人家的东西有问题.
实验结果大概如下：
我尝试做过IP, phosphoSTAT5的IB没有signal,要不就弱到靠背,
将membrane strip过後, 用anti-STAT5做IB,
结果杂band多, 但没有我要的size,要不也就是很弱,根本没法确定是不是STAT5,
也尝试将liver extract直接做IB, anti-STAT5做出来是有几条band,但size都不对,
另外在底片上110KD以上的部份有像smear的杂讯,以为是liver sample没处理好,
但membrane拿去染coomassie blue又是好好的(band是band,漂亮的很),
也用3T3L1 cell line的cell lysate跑过IB,也有相同杂讯的情形,
所以应该不是liver tissue造成.
一直卡在这瓶颈好久了,望达人们伸出援手,指点迷津.
By the way,
有人遇过做IP前要先将extract在boil buffer中煮过然後再做IP吗ꄊ 一般能做IP的antibody不是认native form的protein? 煮过就......?
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