作者pocheng0227 ()
看板Biotech
标题[求救] inverse-PCR完全没有东西@@
时间Tue Apr 22 14:58:33 2008
我最近在做inverse PCR, 想尝试用这个方式将一个gene的未知序列p出来
gene的大小约2.4kb, 中间1.2kb的序列已知, 之前是用degenerate primer p出来的.
已经连续p两个礼拜了, 调整过不同的PCR condition, 结果都完全没有band
想请教板上的各位, 可能是哪里出问题了?
以下是我的protocol:
1. 3ug genomic DNA digestion (50ml reaction), 37度C, O/N
2. Heat inactivate之後, 直接取出3.5ul or 7ul (约0.2ug/0.4ug DNA)来进行ligation,
ligase浓度400U, in a 100 ml reaction. 15度C, O/N
3. 用PCR extraction kit将ligated DNA纯化
4. PCR reaction:
denaturing 94C 1 min
annealing 50~58C 1 min
extention 72C 3~10min
DNA的量大约40~80ng,
annealing temp.我试了50,55,58C
extention time试了3, 5, 10min
跑出来都完全没东西@@"
primer都是31bp, 前面有加restriction site, 实际和template结合的有22bp,
Tm大概是64~66度.
因为怀疑是不是primer有问题
我拿之前p出1.2kp中间序列的degenerate primer, 和我的primer交叉来跑PCR
可以p出东西, 位置也没错.
所以现在不晓得是哪个步骤出了问题@@"
拜托有经验的人提供意见, 谢谢:)
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