作者Nox4156 (人真好!)
看板Biotech
标题[求救]请问一下纯化inclusion body的方法@@
时间Wed Apr 23 18:41:02 2008
请问一下各位@@! 我在纯化inclusion body时 (我的protein带有His-tag)
破完菌，离心完後取沉淀物 以含有1% Triton X-100之buffer洗完五次後
再用不含1% Triton X-100洗完最後一次後 离心取沉淀加入含有6M Gu.HCl之buffer
然後放在室温下旋转到明天
隔天後，离心取上清加入Ni-NTA agarose 旋转隔夜後
以含有6M Gu.HCl之buffer (含有10mM, 100mM, 500mM imidazole)流洗之
後来取5ul以bradford assay都测不到蛋白质 但是flowthrough的部分却很蓝!
(但是我发现流洗的时候Resin的颜色变成了白色的了!@@)
我猜测是不是Resin内的Ni已经被流洗掉而失去功能了~
还是说这一个Resin无法耐到这麽高的浓度?
如果我改用HisTrap FF的管柱不知道行不行的通~
(我有去查Manual，里头说可以耐到4~6M的Gu.HCl)
如果改用成8M Urea会改善吗? 谢谢各位罗^^
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◆ From: 140.112.79.199
1F：推 rurica:理论上用 imidazole 流洗下蛋白质後 Ni 还会留在 column 04/23 20:27
2F：→ rurica:所以变白是不正常的 再来就是 你的 gel 跟 GE 的 04/23 20:28
3F：→ rurica:不见得一样 所以我也不知道他能耐到多少 04/23 20:29
4F：推 ycyyyy:我用过磁珠纯化过inclusion body 效果很好 可以试试 04/23 22:46
5F：→ Nox4156:请问磁珠是怎样的纯化方式呢? @@! 04/23 23:13
6F：推 alaric:buffer pH 检查一下, 可能变太大了... 04/23 23:41
7F：推 qoopig45:那个wash的imidazole的浓度是参考厂商说明书的建议? 04/24 01:04
8F：推 sqqs:先配好1M imidazole stock solution, pH要调到8.0左右 04/24 01:12
9F：→ sqqs:cell lysate里头不能含有EDTA或EGTA ，因为会吃掉Ni 04/24 01:15
10F：→ sqqs:Ni-NTA purification under protein denaturation conditon 04/24 01:18
11F：→ sqqs:是不需要用imidazoole的....最好先详读manual 04/24 01:21
12F：推 bluejelly:假如没记错 Ni-NTA manual不建议用这麽高浓度GnHcl 04/24 08:24
13F：→ bluejelly:可试8M Urea 另外和gel incubate後 wash前的flowthrough 04/24 08:24
14F：→ bluejelly:有留下来检查吗? 可排除在binding step就出问题的可能性 04/24 08:25
15F：→ bluejelly:另外Ni-NTA纯化denature蛋白质是可以加imidazole的 04/24 08:26
16F：→ bluejelly:manual上虽没建议但若有其他non specific binding 04/24 08:26
17F：→ bluejelly:也可加 04/24 08:27