作者crazyrange (热血羽球)
看板Biotech
标题Re: [求救] 关於real-time PCR的问题
时间Thu Apr 24 19:13:04 2008
我跑完RT之後
我试图测量里面的DNA浓度
我的作法是同样sample分别加入A:1ug及B:2ug RNA template进行RT
结果出来之後我分别去测量里面的DNA及RNA浓度
得到的结果为
DNA浓度 A260/280 RNA浓度 A260/280
A 1.9732ug/ul 1.83 1.5475ug/ul 1.87
B 2.0285ug/ul 1.83 1.6260ug/ul 1.89
让我觉得疑惑的是
1.为什麽还测得到RNA,是因为原本的template吗?可是我只加入1or2ug补到20ul中,
怎麽测出来的浓度这麽高.而RNA的浓度也没有成两倍比例,是因为pipette error?
2.测出来的DNA没有呈现两倍的差异,是因为其中含有dsDAN及cDNA吗?
所以只有cDNA是变成两倍而dsDNA没有,所以才会造成total DNA不会呈现两倍差?
3.如果有一组C他与B的条件相同只是不同sample,那麽同样加入2ug进行RT之後,
出来的cDNA量是否是跟B一样,因为一开始用同样量的RNA?
4.还是说因为抽出来的RNA包含tRNA.mRNA.rRNA,而RT只有将mRNA转成cDNA?
还是全部的RNA都会被转成cDNA?
RT的条件是(kit的条件)
25度C 10分钟
37度C 120分钟
85度C 5秒钟
我看paper上说做RT前会将RNA与primer混合,
然後在65度C反应10分钟再放到冰上
接着在加入其他材料
然後才依照温度与时间做RT反应(42度C 50分钟;70度C 15分物钟)
5.我的第 一个温度是25度C的室温
请问这会有麽差异吗?
谢谢各位 帮我解决我的困惑
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※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 59.120.7.114
1F：推 piggylo:你是不是用ABI的kit转RNA的？我们家也是用这个，应该是没 04/24 20:47
2F：→ piggylo:问题。而你提到另外一个不同的温度设定应该是因为不同家的 04/24 20:48
3F：→ piggylo:RT，所以才有不同的作法。 04/24 20:49
4F：→ piggylo:至於转成cDNA後需不需要测浓度，我之前有问过厂商，她们是 04/24 20:50
5F：→ piggylo:度测定，所以她们是建议就把cDNA的浓度视为跟当初反应的 04/24 20:51
6F：→ piggylo:RNA浓度相同就好了。 04/24 20:53
7F：推 piggylo:sorry,有字不见了，所以再补充一下 04/24 20:54
8F：→ piggylo:厂商是说RT所加的dNTP会干扰後来的浓度测定，所以转成cDNA 04/24 20:55
9F：→ piggylo:後不需要测浓度。 04/24 20:56
10F：推 amide:NanoDrop测RNA/DNA只是单纯测260吧 只有乘回去的factor不一 04/24 23:42
11F：→ amide:样吧 没有办法分出RNA或是DNA? 04/24 23:42
12F：→ crazyrange:谢谢P大的解说 我们家是用ABI的KIT没错 04/25 09:27
13F：→ crazyrange:请问A大,那看浓度的时後,要直接以他上面显示的浓度 04/25 09:31
14F：→ crazyrange:为准,还是以A260去乘以factor来换算浓度好？ 04/25 09:31
15F：→ crazyrange:更正.我後来发上面两者是一样的 04/25 11:35