以个人最近操作相关实验所遇到的问题 整理一下可能需要小心的部分 1.通常给RealTime PCR 使用的RNA sample会做DNase treatment的原因 多是为了避免genome DNA干扰..如果你的cDNA片段在genome DNA也有一模一样的 利用SYBR green 或是TaqMen都会被测出来 这样的读值，就非单纯因为RNA转录出来的cDNA所造成的 所以通常会有以下两种方式排除genome DNA的干扰 A.RNA sample 利用DNase treatment.... B.primer design 跨过junction..... 也就是跨过一个intron..这样也可以避免genome DNA的污染 EX:如下图 == 代表 exon -- 代表 intron __ 代表 primer 5'__ ========-----------------======== exon intron __ 3' 补充说明原理：RealtimePCR的产物通常都很短... 而genome DNA上的intron如果被PCR出来，常是好几K或数百bp 以RealtimePCR常用的短时间anealing time 来说，不太PCR的出来 另 在Dissociation Curve中也会看到不同温度的产物.... 2.另外一种DNA污染，plasmid ..... 如果要测定的A基因已在同一个实验室中重复反覆的一直操作 只要primer设计时在ORF中......无论有无intron的设计 primer都会在含有A基因的plasmid中PCR出相同的产物 如果在抽RNA的操作上稍有不慎....很有可能发生类似的状况.... 或是 Realtime PCR 操作中时，都有可能发生 解决方式.. A:使用有filter的tipe操作RNA纯化和Realtime PCR B:RNA纯化之後，利用DNase treatment...再进行RT转录 C:在Laminar Flow中操作Realtime PCR 避免plasmid 污染 D:在有plasmid 污染的状况下，水或所有试剂 都要特别小心处理 3.RNA抽完之後，我通常会跑一片RNA gel确认一下RNA的品质 因为RNA 如果已经degrade了..跑胶是最容易看出品质的方式 OD值有时反而没这样的直觉性.... 4.通常RNA取一定的量之後做RT...... Sample就以RNA当初所取的量为主，再取相同体积的cDNA来做实验... 另 有时会有人为了确定RT 与 NoRT 的差异比较 而取相同量的RNA与已经RT过的cDNA做相对比较，来证明RT是在此次实验中是成功的 Deta所呈现的数值是可信的.............. 5.最後 你提到RT前为何要先在65度反应 主因是 RNA常有二级结构的问题 利用65将结构打开，以利之後RT的反应完整.... ※ 引述《crazyrange (热血羽球)》之铭言： : 我在萃取RNA之後 没有用DNase : 结果我在测量RNA量的时候 我也同时去测量DNA的量 : 的确也侦测到了DNA的量 而且还不低 : 我想请问一下 : 在我抽取的RNA中还有DNA的话 : 对於我接下来要做的RT会有很大的影响吗? : 我是这样想的 : RNA是单股 DNA是双股 : 可是在跑RT的时候 加入的过程中DNA会分解成单股 : 而加入的primer是random primer : 这样的话在做RT的时候 DNA是不是也会被反转录? : 那如果在萃取完RNA後加入DNase去反应 : 是否之後在测量RNA浓度的时候就会测不到DNA的存在? : 在RT之後的cDNA需要测cDNA浓度吗? : 还是说因为在跑RT之前的RNA就已经是固定量(ug) : 所以RT出来的cDNA可以不用测 不同sample可以直接用同量(ul)的template : 去跑real-time PCR? : 整个疑惑 -- 夜生活不只是一种生活，更是一种态度，音乐有很多类型，夜店有很多种类 喜欢与否只是一种偏好，却不代表全部的选择，夜生活的多样与多变应该是 让人有更多更广的眼光看生活与体验......... --

※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc) ◆ From: 123.192.165.143