作者sharkcell (压力渐渐变大)
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标题Re: [求救] 2D真难搞
时间Mon Apr 28 01:39:49 2008
※ 引述《kakaman (日子过的真快阿)》之铭言：
: ※ 引述《kakaman (日子过的真快阿)》之铭言：
: sample的处理是把细胞离下来後
: 用lysis buffer(CHAPS+Urea)+PMSF去破细胞
: 放在冷房摩天轮转一个小时
: 接着13000rpm 20min
: 吸上清液 定量後上IEF
我来说说我之前硕士做2D sample preparation的过程：
1.400uL蛋白质粗抽液+100uL 50%TCA in Acetone
(由於我的sample是叶片，为了去色素使用Acetone)
2.votex均匀後置於-20度1小时以上
3.4度下12000rpm 离心10 min
4.利用iced Acetone清洗pellet三次
(均需搅散pellet後离心再去除Acetone)
5.以Rehydration buffer回溶(即原po的lysis buffer)
6.利用sonicator在冰上震荡30~60min增加回溶
7.12000rpm 10min 4度C後去除pellet留下上清液以BCA定量
整体来说
做蛋白质实验时切记冰上处理
以免产生carbamylation
利用沉淀法来去除一些cell中的contaminants
(ex:lipid,DNA/RNA,polysaacharides等)
常用沉淀法有:
1.TCA (Add TCA to extract to final conc.10-20%)
2.Acetone (Add at least 3 vol. of ice-cold acetone into extract)
3.50% TCA in Acetone(将5g TCA溶於10mL Acetone中)
(final TCA conc. is 10%)
希望有帮上一点忙
另外染色法也会影响你观察2D的结果
常用CBR,silver stain或是Zinc stain
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