※ 引述《tzengchichau (无)》之铭言： : ※ 引述《[email protected] (星空下的神话)》之铭言： : : 想请问一下各位先进 : : 在纯化蛋白质中，我要纯化his-tag的融合protein，使用的是Ni-NTA来纯化， : : 想请教的部分就是： : : 1.为什麽buffer的ph值是保持在7.9呢? : PH值也会影响his_tag PROTEIN binding 但PH值只要7.4_到8都可以啊 : 不一定要在7.9。 : : 2.binging buffer中有的会加入imidazole,这个物质不是只和histidine竞争Ni，为什麽 : : 会用在binding buffer里呢?(其实也想问一下binding buffer的功能是什麽) : 低浓度的IMIDizole是用来洗去column非专一性的结合蛋白。 : 也可以再加入高浓度的NACL这样最後收集的蛋白会比较纯 : : 3.elution buffer中有imidazole我能理解，可是washing buffer中为什麽也有呢? : : 实验室使用的imidazole浓度分别为： : : 8X binging buffer：40mM imidazole 我猜你要打的是binding buffer : : 8X washing buffer：480mM imidazole : : 4X elute buffer：4M imidazole : : 求救一下了>"< binding buffer有imidazole是为了减少非专一性蛋白 washing buffer当然也要用imidazole 理由也一样 为了增加纯度 会跟ni-nta接合只要有imidazole group就能接合...很难避免只能减少 所以很多非你目标的protein也能去抢这些接合位 在wash的时候当然要用一些去把他洗掉..当然同时也会牺牲一些你的目标protein -- 上帝曾经说过 : 当一个人打你右脸的时候 你就要用日耳曼背桥摔坏它的左脸 --

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